全基因组de novo测序(二代／三代)-诺禾致源-Nanopore辅助组装注释Pacbio sequel II

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基因组De novo测序

基因组De novo测序—开启物种真正探索之路

基因组从头测序（De novo sequencing）在不依赖参考基因组的情况下对某物种进行基因组测序及拼接组装，从而绘制该物种的全基因组 序列图谱。基因组测序不仅可以获得该物种的全基因组序列图谱，同时也为后续物种起源进化及特定环境适应性的研究奠定了基础。根据基因组的复杂程度，基因组可分为 简单基因组和 复杂基因组。

	简单基因组	复杂基因组	超复杂基因组
重复序列比例	＜50%	50%~65%	>65%
杂合率	＜0.5%	0.5%~1%	>1%

诺禾优势

1.高质量测序数据
基因组De novo 测序采用先进的PacBio Revio、Nanopore PromethION测序平台，快速、高效地获取长读长（10Kb～Mb）、高质量（>Q20）的测序数据。诺禾致源高性能计算平台（High Performance Computing，HPC）采用DELL计算节点和Isilon存储的高效组合，实现快速稳定的测序数据分析及交付。随着公司业务的发展，高性能计算平台将会持续更新并扩容，以保证高效的数据处理和安全的数据存储。
- 10K起
  测序读长
- ≥90%
  测序质量Q30
- 20,280个
  物理核数
- 1,727 ^{T flops}
  计算峰值速度
- 400 ^TB
  总内存
- 58.6PB
  总储存

2.科学方案设计

从材料选取，建库测序，到数据分析，每一步都需要科学、缜密的设计，以保障高质量研究成果

	常规测序	近完成图策略	T2T	<500M昆虫
构建Contig	>30× PacBio CCS （HiFi）	>30× PacBio CCS （HiFi） + >30× Ultra-long ONT	>60× PacBio CCS （HiFi） + >100× Ultra-long ONT	1个cell超微量CCS建库（HiFi）
构建染色体	>100× Hi-C
基因组survey （评估）	>50× Illumina/T7-350bp
样本要求	DNA总量>10 ug 送样指南链接>>

3.高质量组装结果
采用Hifiasm、Falcon、Canu、Wtdbg2、Nextdenovo等基因组组装软件及Racon、Quiver（Arrow）、Pilon、Nextpolish等纠错软件，从纯三代到与新技术混合拼接。针对不同的基因组特征，采取不同的策略，致力于得到高质量的组装结果。
- 4⁺月
  项目周期
- 1593.57
  影响因子
- ALL
  分析内容
4.项目经验丰富
诺禾致源的基因组合作项目遍布全球各地，带动基因组研究潮流。 2020年至2022年12月，发表高水平基因组文章43篇。研究涉及鸟类、哺乳动物、水产生物、珍贵动物、昆虫、栽培作物、水果植物、药用植物、藻类、林木类、灌木类等诸多物种。
- 50人
  分析团队
- 8年
  项目经验
- 500+
  结题项目
- 1对1
  项目服务

信息分析

基因组序列是研究物种分子生物学的基础，通过全基因组De novo测序，可得到物种全基因组序列图谱，通过比较基因组学分析可对物种进行基因家族分析，系统进化分析，正选择分析和共线性分析。

De novo 测序	分析内容
组装	组装策略组装结果评估
注释	重复序列注释基因结构注释基因功能注释非编码RNA注释
生物学分析	比较基因组学	基因家族分析
		系统进化分析
		正选择分析
		共线性分析
	个性化分析	针对物种自身特点制定分析方案

常见问题

1. 如何保证组装结果的可靠性？组装完整性和准确性的评估方法主要有哪些？

对于组装的结果，除了保证 Contig N50 和 Scaffold N50 两项指标外，还需要对组装质量进行评估。如BUSCO评估、LAI评估、Merqury评估、CEGMA评估、EST序列评估、RNA序列评估、一致性评估、BAC克隆序列评估；其中BUSCO评估使用单拷贝直系同源基因库对基因组进行评估，LAI评估使用长末端重复序列来评估基因组完整度，Merqury对基因组的QV进行评估，目前这三种评估方式较为常用。组装完整性和准确性的评估方法主要有以下几种：

组装完整性及准确性评估方法	数据需求
组装结果统计	基因组文件
一致性评估	基因组文件 / 二代短读长数据
BUSCO 评估	基因组文件
LAI评估	基因组文件
Merqury评估	基因组文件
CEGMA 评估	基因组文件
BAC克隆序列评估	基因组文件/BAC数据
EST 序列评估	基因组文件 / EST 数据
RNA 序列评估	基因组文件 / RNA-Seq 数据

2.De novo 组装的推荐策略是什么？
- 一般情况下 De novo 项目必须具备 50-100X 的三代测序数据和 100X 的 illumina 二代短读长数据用来做组装和纠错。同时可以增加100X Bionano，100X Hi-C 数据来辅助组装增加组装连续性，提高组装准确性。目前较为推荐的组装策略是：（1）高质量基因组：30× PacBio HiFi + 100× Hi-C + 50X illumina （2）近完成图基因组：30× PacBio HiFi + 30× Ultra long ONT + 100× Hi-C + 50X illumina （3）T2T基因组：60× PacBio HiFi + 100× Ultra long ONT（N50≥100K）+ 100× Hi-C + 50X illumina

3.Hi-C 辅助组装如何送样？
- Hi-C 项目建议送新鲜的活体样本，如果非活体要冻存寄送，非经验物种类别生产都会判风险建库。一般会先试测1 Gb，评估数据有效率合格才安排加测。 Hi-C项目建议送新鲜的活体样本，如果是酒精浸泡或胶块包埋会影响建库的质量，还有如果是一些特殊物种，类似虾蟹、昆虫、次生代谢物、寄生物等样本可能会被判定为风险建库，会对结果造成一定影响，所以，一般情况下会先试测1 Gb的数据，评估数据有效率合格后再安排加测。

4. Survey 和基因组 De novo 所用 DNA 是否需要一样的？
- 原则上进行 Survey 和De novo 的DNA是需要使用来自同一个个体的。如果DNA量不足以满足整个De novo项目，则建议小片段文库的DNA必须来自同一个体，三代大片段甚至超长片段的DNA文库使用同一群体的另一个个体。

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