外显子组测序-诺禾致源-WES内含子多组学基因测序

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外显子组测序

WES—高深度检测编码区域遗传变异

外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）利用探针杂交富集外显子区域的基因组序列，结合高通量测序检测与蛋白质功能变异相关遗传突变的技术手段。相比于全基因组测序，外显子组测序更高深度、更加经济、高效。 高性价：直接对蛋白编码区测序，缩小研究范围和数据量；
强分析：可分析常见变异、罕见变异和低频变异。

应用方向

人类遗传病：
家系样本或散发样本研究；
单基因疾病或复杂疾病研究；
人群队列研究（GWAS、Burden等）；
多组学研究。
人类癌症：
呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、生殖系统肿瘤、内分泌肿瘤、头颈部肿瘤、颅脑部肿瘤等肿瘤研究；
肿瘤体细胞突变、突变特征、肿瘤进化、新抗原预测等研究；
肿瘤遗传易感基因分析等研究。

诺禾优势

1.捕获技术稳定
采用Agilent SureSelect 人类外显子探针和捕获平台，实现稳定且高效捕获人类编码区基因组序列。

材料选取

DNA样品
≥0.4μg

文库构建
180-280bp

PE150测序

信息分析
- Aglient SureSelect
  捕获平台
- 25^天
  项目周期
- 60^M
  捕获区间
2. 周期快、稳定性高
诺禾致源高性能计算平台（High Performance Computing，HPC）采用DELL计算节点和Isilon存储的高效组合，实现快速稳定的测序数据分析及交付。高性能计算平台将持续更新并扩容，以保证高效的数据处理和安全的数据存储。
- 20,280个
  物理核数
- 1,727 ^{T flops}
  计算峰值速度
- 400 ^TB
  总内存
- 58.6PB
  总储存
3. 项目经验丰富
已有大量客户选择诺禾致源作为合作伙伴开展疾病或癌症研究，成功完成对多种癌种和疾病的测序分析，已在Nature Communications、Journal of Hepatology、Gut等高水平期刊上发表合作文章。
- 60人
  分析团队
- 7年
  项目经验
- 5000+
  结题项目
- 1对1
  项目服务

信息分析

标准分析+高级分析+个性化分析是可提供的完整分析方案。外显子组测序数据通过将严格质控和比对，采用可靠分析方法检测外显子组变异信息，为遗传病和癌症研究奠定基础。

疾病基因组学
基本信息分析	高级信息分析	个性化信息分析
1.数据质控：去除接头污染和低质量数据 2.与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度 3.样本性别质控 4.样本 IBD 质控 5.SNP / InDel / CNV 检测、注释及统计 6. SNP / InDel / CNV 关注优先级标记	基于变异有害性的筛选 1. 突变位点筛选 1.1 筛选的突变过滤已知数据库； 1.2 筛选的变异保留编码区或剪切位点区的变异位点； 1.3 氨基酸保守性预测（SIFT，PolyPhen，MutationTaster，CADD 等软件预测） 2．突变位点有害性分类（ACMG） 3．结构变异 CNV 有害性分析基于选样信息的筛选 1. 显性/ 隐性遗传模式分析（需合作方提供家系图） 1.1 显性遗传模式 1.2 隐性遗传模式 2. 新生突变筛选（仅适用于核心家系） 2.1 de novo SNP/InDel 筛选 2.2 de novo CNV筛选 2.3 SNP/InDel 新生突变速率计算 3. 家系连锁分析（仅适用于：家系样本） 4. 纯合子区域（ROH）分析（仅适用于：近亲结婚的家系样本） 5. 共有突变基因筛选（仅适用于散发样本）基于基因功能和表型的筛选 1. 蛋白功能互作网络（PPI 分析） 2. 候选基因功能富集分析 3. 候选基因通路富集分析 4. 候选基因与疾病相关性排序 HLA 分型分析此部分独立于其他高级分析，可与经典分析同时签订也可单独签订： HLA 分型分析 1.与参考数据库 IMGT／HLA 进行比对、统计测序深度及覆盖度 HLA 分型、注释	1. 药物效应多态性的遗传学机理研究使用 PharmGKB 和 Drugbank 数据库对药物基因组项目进行注释和分析，需客户提供所关注的药物名称 2. 生存分析（基于临床随访数据） 2.1 构建 COX 风险比例回归模型 2.2 生存曲线 2.3 绘制曼哈顿图 2.4 绘制 Q-Q 图 2.5 绘制 Locus Zoom 图 3. 疾病显著性关联位点分析（建议基于 150 对以上 case/control） 3.1 Fisher 精确检验 3.2 绘制曼哈顿图 3.3 绘制 Q-Q 图 3.4 绘制 Locus Zoom 图 4. 疾病显著性关联基因分析（建议基于 100 对以上 case/control） 4.1 SKATO 统计检验 4.2 绘制 Heat map 图备注：Control 的选择范围（1）客户准备 control 样本，和 case 样本并行测序后，进行关联分析；（2）可以免费利用诺禾内部自然人数据库 Novozhonghua 作为 control 来做关联分析（3）可以利用数据库 GnomAD 作为 control 来做关联分析。 5. 基于HLA型别的关联分析

癌症基因组学
基本信息分析A	高级信息分析	个性化信息分析
1.数据质控：去除接头污染和低质量数据 2.与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度 3. 聚类分析样本间一致性 4. Somatic SNP / InDel / CNV 检测、注释及统计（成对样本）	癌症经典高级分析 1. MRT 高频突变基因相关性分析（>2对样本） 1.1 高频突变基因协同作用分析 1.2 高频突变基因互斥作用分析 2. 驱动基因预测（>2对样本） 2.1 OncodriveCLUST 2.2 OncodriveFM 2.3 驱动基因整体预测 3.突变位点分布情况分析 4. 高频 CNV 分析 4.1 CNV 分布分析 4.2 高频CNV 分析（>2对样本） 5. ABSOLUTE肿瘤纯度及倍性分析 6. 杂合性缺失（LOH）分析 7. 克隆结构分析 7.1 体细胞突变 CCF 分析 7.2 单样本克隆结构分析（Pyclone） 8. NovoDrug 靶向用药预测 9. NovoDR耐药突变筛选癌症免疫基因组分析 1. 新抗原相关简介 1.1 新抗原预测 1.2 新抗原与突变负荷分析 1.3 主亚克隆新抗原分析 1.4 HLA 突变分析 2. 错配修复分析 2.1 错配修复基因突变分析 2.2 错配修复特征分析 3. 微卫星分析 3.1 单样本 MS 状态分析 3.2 成对样本 MS 状态分析（Somatic） 3.3 高频 MSI 基因筛选	1. 肿瘤进化树分析 2. 多样本克隆结构分析 3. 临床数据整合 4. 突变频谱3D展示图 5. Conpair分析样本间一致性和污染程度
基本信息A+
1. 易感基因筛查 2. 高频突变分析（>2对样本） 2.1 高频突变基因统计 2.2 高频突变基因富集分析 3. NMF 突变特征/突变频谱分析 3.1 突变频谱分析 3.2 NMF突变特征分析（>2对样本） 4. NovoDriver已知驱动基因筛选 5. 基因组变异 Circos 图展示

动植物多组学

疾病多组学

癌症多组学

微生物多组学

转录调控和蛋白多组学

表观遗传

送样建议

组织类型	送样建议
冻存组织：	大于0.1g
培养细胞数量	＞5×10⁶个
全血	＞1ml
FFPE	厚度在5-10μm,含组织面积大于25mm2的切片6张
DNA	总量∶> 500ng
血浆/血清	＞3ml

常见问题

1.外显子测序适用于什么种类的研究？
- 在人类基因中大约有180,000个外显子，外显子CDS区大小占人类基因组的1～2%，约30 Mb。人类基因组的蛋白编码区大约包含85%的致病突变。外显子组测序主要是针对编码区进行检测，所以外显子组测序主要适用于编码区潜在变异引起的疾病研究。测序性价比高，尤其适合高深度、大样本量的测序，可找出常见突变及低频突变。主要应用在孟德尔遗传病及肿瘤等复杂疾病的研究。

2.外显子测序可以检测哪些类型的变异？
- 外显子捕获是一个杂交捕获的过程，探针与不同外显子区段的杂交效率并不相同，进而不同外显子区段的覆盖深度差异较大，因此通常外显子测序不能用于CNV的检测。但我们采用国际主流软件和长期优化的分析方法可以针对单个样本进行SNP、InDel和CNV变异检测。

3.使用的捕获平台是什么，有哪些优势？
- 我们使用的是Agilent SureSelect Human All Exon V6捕获平台，该产品汲取多个权威数据库（如RefSeq，OMIM_cds）的核心内容，具有更大的捕获区间，更高的捕获效率，保证外显子编码区的高覆盖率及SNP检出率。

4.外显子测序为何强调“有效测序深度”，与“测序深度”的概念有何区别？
- 首先明确两个概念：测序深度：测序得到的总碱基数与目标区域大小的比值。捕获效率：比对到参考基因组中目标区域的数据量占比对到参考基因组上总数据量的比例。例如：若使用Agilent Sureselect Exome Kit V6，试剂盒的捕获范围为60M，测序得到600M数据量时，测序深度为600/50=10×；但是由于外显子试剂盒会有捕获效率，大约在60%以上，所以实际上目标区域数据量只有600M*60%=360M，目标区域测序深度 360M/60M=6×，称为target depth。

5.疾病基因组外显子测序深度怎么考虑？
- 2015年发表在Genomics & Informatics上的一篇文章显示外显子组测序深度会影响变异检出率。基于同样的方法，诺禾致源疾病基因组事业部选取3个不同疾病的样本进行检出率和一致性评估，发现：使用外显子组测序,相比于常用的50×有效测序深度，100×有效测序深度下，功能性SNPs ( coding SNPs 、missense SNPs）和罕见变异（Rare SNPs, MAF0.5%）的检出数量以及目标区域中20×以上覆盖深度碱基所占的比例，均达到一个很平稳的状态，可以得到显著、可靠的变异检出（如图1-图4）。

6.癌症基因组学测序为什么通常选取同一个患者成对的癌组织和癌旁组织/血液样本？
- 癌症基因组学侧重于研究肿瘤细胞特有的、非遗传因素导致的体细胞突变，因此我们需要选取患者的正常组织进行测序，以过滤germline mutations。由于考虑到个体间germline突变差异很大，为避免筛选出很多假阳性体细胞突变位点，肿瘤和正常组织需来源于同一个体。

7.癌组织为什么要采用高深度测序？
- 相对于遗传病而言，肿瘤组织样品中突变位点的等位基因频率较低，一方面由于肿瘤细胞在肿瘤组织中的占比偏低，另一方面则由于癌症发展后期产生的突变仅存在于极少量的肿瘤细胞中，采用高深度测序可以尽可能全面的检测到与癌症发生发展相关的变异。通常推荐的外显子测序深度为，癌组织大于200x，癌旁组织/血液大于100x。

8.FFPE样本和ctDNA研究适合用外显子测序吗？
- 适合，FFPE样本和ctDNA由于样本自身的特性，存在DNA片段化、起始量不足等情况，高深度的外显子测序可以通过增加变异位点reads的支持数，提高变异检出的准确性。

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