完美基因组—抵达探索生物奥秘的终点

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完美基因组（T2T基因组）

完美基因组—抵达探索生物奥秘的终点

T2T（Telomere-to-telomere）基因组：是指组装的无gap的端粒到端粒的基因组（在rDNA区域、性染色体、着丝粒中可能允许少量gaps）；具有非常高的Q值（准确性）和BUSCO值（完整性）；在原始数据与组装之间具有最小的结构性错误。

1.策略推荐
60X HiFi + 100X Ultra-long ONT（N50 > 100K）+ 50X 二代 + 100X Hic
（1）60X HiFi数据使用Hifiasm进行组装，得到HiFi contig，较常规组装（30X）深度更高，可得到完整性、连续性更高的contig骨架基因组，同时还可为单体型-T2T提供深度支持，进行单体型-T2T组装；
（2）100X Ultra-long ONT（N50 > 100K）数据使用Nextdenovo进行组装，并使用50X Illumina数据进行纠错，得到ONT contig，使用Ultra-long ONT组装目的是得到片段超长的contig基因组；
（3）100X Hic数据经Hicup质控，对Hifi contig及ONT contig两版基因组进行Allhic挂载得到基因组染色体版本；
以HiFi 染色体级别基因组作为Reference，将Ultra-long ONT染色体级别基因组与其进行相互Merge，最终得到T2T级别基因组。
2.T2T基因组质量评估
T2T基因组组装完成后，需要进行以下评估内容：
1）基因组评估：包含BUSCO评估（>95%）、序列一致性评估(>98%)、QV评估（>45）等。
2）与该物种发表最佳版本基因组进行共线性评估：Mummer。
3）着丝粒、端粒鉴定：对着丝粒、端粒进行预测，若研究较成熟物种（序列已知），将其与基因组直接比对查验。例如：人类端粒（TTAGGG）、拟南芥端粒（TTTAGGG）。
4）着丝粒也可使用Chip-seq、FISH等实验进行验证。
5）填补Gap区域可使用PCR实验进行验证。
诺禾致源端粒、着丝粒鉴定及已发表基因组比对
3.适用物种推荐
动物：哺乳动物、淡水鱼类（详细评估）。
植物：3G以内常规物种，如玉米、大豆、棉花等。
特殊物种：部分异源多倍体可承诺（仅限棉花、油菜等）。
4.应用方向

案例展示

Two telomere-to-telomere gapless genomes reveal insights into Capsicum evolution and capsaicinoid biosynthesis

两个辣椒T2T基因组揭示辣椒进化和辣椒素生物合成的简介^[1]

研究对象：辣椒
期刊：Nature Communications
影响因子：16.6
合作单位：北京大学现代农学院
发表时间：2024年5月20日

研究思路：

研究结果：

（1）T2T无缺口辣椒基因组组装
得到了两个辣椒的T2T无缺口基因组。C. annuum（CaT2T）包含12条染色体，基因组大小为3.1 Gb，contig N50为262.6 Mb； C. rhomboideum（CrT2T）包含13条染色体，基因组大小为1.7 Gb ，contig N50为146.0 Mb。
（2）基因组验证和注释
CaT2T和CrT2T的质量值（QV）分别为56.60和77.18，BUSCO分别为98.62%和97.12%，这表明两个基因组具有很高的准确度和完整度。重复注释显示，C. annuum和C. rhomboideum基因组中79.5%（2.45 Gb）和74.6%（1.28 Gb）是重复序列。通过整合abinitio预测、同源蛋白和转录组数据等证据，在CaT2T和CrT2T中分别预测了34,428和33,512个蛋白编码基因。CaT2T填补的Ca59的Gap区域中共编码614个基因，其中110个是CaT2T中新注释出来的。
（3）辣椒的着丝粒广泛受到CRM逆转录转座子的侵入
本文首先通过C. annuum的CENH3 ChIP-seq数据确定CaT2T的着丝粒，该数据清楚地划定了CaT2T中12个着丝粒的位置和边界。该研究还发现，着丝粒中的LTR插入爆发比整个基因组中的爆发要晚，这表明最近的着丝粒进化是由LTR入侵造成的。此外，共线性分析显示C. baccatum、C. pubescens和C. rhomboideum基因组中CRM反转座子富集的区域对应C. annuum中确定的着丝粒位置，这表明CRM是辣椒着丝粒的一种特征元件，可用于预测或识别辣椒着丝粒的位置。
（4）着丝粒和端粒具有转录和表观遗传活性
基因组注释显示，CaT2T着丝粒中的60个基因在冷冻反应、DNA拓扑变化和减数分裂染色体分离等功能方面具有重要作用。相比之下，CrT2T着丝粒上编码了94个基因，富含对UV-B的响应、光合作用和昼夜节律调节。
（5）辣椒素生物合成途径的进化史
辣椒素生物合成仅限于辣椒属作物，C. baccatum在约5百万年前与C. annuum和C. chinense分离，后者与不能产生辣椒素的C. rhomboideum在约13.4百万年前分化，这表明辣椒素生物合成途径可能是在约5-13.40万年前起源的。转录组分析显示CBG基因在辣椒果实中高度表达，而在不辣的植物如番茄、马铃薯、酸浆和野生辣椒中CS基因几乎不表达。
（6）染色质可及性调控组织特异性的辣椒素生物合成
RNA-seq分析显示，CS及其转录调控因子MYB31和MYB48在胎座中特异性表达。提取了ATAC-seq鉴定到在多个CBG基因周围的OCR中发现了MYB等转录因子结合位点，表明转录因子（如MYB31）可能特异识别这些OCR区域内的顺式元件，实现在果实组织中协同调控CBG表达。

参考文献

[1]Chen, W., Wang, X., Sun, J. et al. Two telomere-to-telomere gapless genomes reveal insights into Capsicum evolution and capsaicinoid biosynthesis. Nat Commun 15, 4295 (2024).

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