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Ribo-seq ——解析多聚核糖体翻译过程
核糖体印记测序, 可以对正在翻译的RNA进行检测。Ribosome profiling是针对与核糖体结合、长度约为30nt的正在翻译的RNA片段进行富集、测序和定量。据此可推测起始密码子位置(包括非AUG起始)以及uORFs等信息。-
物种广、瞬时性
作为连接转录和蛋白层面的桥梁，Ribo-seq对瞬时停止翻译延伸过程的样本进行高通量测序分析。解析多聚核糖体在RNA上的翻译印记。在翻译层面解析生命过程中的差异表达基因，如：环境刺激、代谢或疾病发生，影响翻译效率；RNA结构或转录组后修饰，影响翻译产物。为科研工作展开新的视角。
应用方向
翻译组适合生命体生长发育等各个阶段、部位或方面的研究。-
生长发育
人、小鼠、斑马鱼等细胞、组织生长发育研究。 -
癌症疾病
疾病、癌症发生发展等研究。 -
植物
植物胁迫、生长发育、开花、遗传育种等研究。
诺禾优势
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1. 周期快、质量好，稳定性高
诺禾Ribo-seq采用先进的Illumina平台测序，并与高性能计算平台（High Performance Computing，HPC）结合，实现快速、稳定的测序数据分析及交付。交付周期<80天。 -
2. 方案设计专业，质控严格
针对动物细胞、细胞裂解液、动/植物组织、RPF等建库中间产物，设计不同的项目方案，调整试验protocol，每一步都需要科学、缜密的设计，以保障高质量研究成果。要求碱基分布主峰 在28-30nt之间，主峰片段具有显著的三碱基周期性。材料选取
RPFs
文库构建
Ribo文库
SE50测序
信息分析
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3. 项目文章以及物种经验丰富
诺禾致源已经成功完成对人、大小鼠、鸡、山羊、猪、海产动物等细胞和组织样本；拟南芥、杨树、烟草、番茄、菊花、玉米、大豆、水稻、棉花等组织和RPF样本； 疟原虫、昆虫等。助力客户在Nucleic Acids Research、Science Advance等权威杂志发表多篇高水平文章。80人
分析团队5年
项目经验500+
结题项目1对1
项目服务
信息分析
标准分析流程：该部分的分析与mRNA-seq数据进行关联，主要分析的是样本的翻译效率及翻译全局景观的分析。（无mRNA数据，则不呈现翻译效率（TE）分析内容）个性化分析：该部分为Ribo-seq与lncRNA-seq及蛋白质组数据的关联分析，主要内容为新可翻译分子的鉴定、蛋白质组差异表达关联分析。
关联分析
通过Ribo-seq与mRNA基因表达进行关联分析，可以帮助我们了解转录本的翻译效率，样本中的哪些基因的表达受到翻译层面的调控以及对应的基因的功能。因此Ribo-seq和mRNA转录组的联合分析 广泛应用于疾病研究、生物性状等多种领域。通过Ribo-seq与lncRNA表达进行关联分析，可以帮助我们了解lncRNA中可能存在的小开放阅读框（sORF），预测可能的翻译产物（短肽），这些短肽的生物学功能打开了生物学调控的崭新领域。 因此Ribo-seq和lncRNA的联合分析广泛应用于不同研究场景的多组学联合分析中。
基于多组学文章中的应用场景和经验，诺禾致源搭建了内容丰富的Ribo-seq与转录组关联分析流程，以助力科研者们展开深入研究。
| Ribo-seq与lncRNA关联分析 | 1. 差异TE基因统计 |
|---|---|
| 2. GO功能、KEGG通路富集分析 | |
| 3. mRNA与RPF相关性分析 | |
| 4. mRNA与RPF的表达水平差异比较关联分析 | |
| Ribo-seq与mRNA关联分析 |
1.sORF的鉴定 （1）sORF的数量；（2）sORF差异分析；（3）sORF长度展示； |
| 2.sORF得分图 | |
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3.表达量/翻译水平分析 （1）具有sORF的lncRNA的转录组定量和差异水平展示（2）具有sORF的lncRNA的翻译组定量和差异水平展示 （3）sORF的翻译效率和差异水平展示 |
送样建议
| 样本类型 | 送样建议 | 预处理 |
|---|---|---|
| 新鲜动物组织 | ≥300mg | RNase free 水漂洗以去除污物， 剔除结缔组织、毛发等非研究组织 |
| 新鲜植物组织 | ≥300mg | RNase free 水冲洗表面，吸水纸吸干样品表面 |
| 新鲜培养细胞数量 | 5×10 6-1×10 7个 | 细胞活性 90%以上,使用放线菌酮固定后，收集细胞 |
| RPF | ≥200ng/μl，10μl 以上 | 蔗糖梯度离心收集或其他方式处理 |
常见问题
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1.同时想做ribo-seq和mRNA-seq，应该怎么送样
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如果同时进行转录组与Ribo-seq分析，需准备两份样品：
（1）ribo-seq：样本不管是细胞或是组织样本（保持细胞组分完整性），不能加trizol，不需要提取total RNA！
（2）ribo-seq：制备细胞样本，需要分离细胞后立即加入含有放线菌酮裂解液中，保持特定状态（研究瞬时性）。
（3）mRNA-seq：裂解液处理的细胞/组织样本不能再进行total RNA的提取。
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如果同时进行转录组与Ribo-seq分析，需准备两份样品：
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2.在片段分布的分析中，21-24bp有峰值，代表什么？
- 用于Ribo-seq测序的目标RNA片段约为30bp左右，不同物种及样本处理会导致目标片段稍有变化，一般为26-32nt。在多数文献中，为26-32nt的mRNA片段富集， 但是已有文献研究表明，在tRNA缺乏的情况下，有可能导致核糖体复合物A位点的空置，该状态富集的mRNA片段约为21-24nt。我们在进行后续翻译状态研究时， 可根据实验目的对25-33nt或者20-40nt的数据进行分析 [1]。
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3.P-site(三碱基周期性)数据的特性有哪些？
- 由于核糖体在转录本滑动翻译蛋白的过程中，会每隔 3个碱基（1个密码子）产生一个停顿，完成一个氨基酸的肽段延伸。我们将比对到 CDS 区的RPF进行分布位置统计， 一般而言起始密码子上游或终止密码子下游不会被翻译或翻译丰度极低，因此对应的RPF信号整体弱于编码区。其次基于Ribo-seq的建库原理，大部分的核糖体在mRNA上 的足迹是3的整数倍，大部分RPF 信号在CDS区是呈现三碱基周期性。最后，理论上RPF 5’端比对位置开始于起始密码子上游 12~13nt，停止于终止密码子上游 15nt左右 的位置，而mRNA-seq 的数据是随机分布的。
拓展材料
参考文献：
[1] Wu C C, Zinshteyn B, Wehner K A, et al. High-Resolution Ribosome Profifiling Defifines Discrete Ribosome Elongation States and Translational Reg-ulation during Cellular Stress[J]. Molecular Cell, 2019, 73(5)
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