陆军军医大学在Molecular Cancer（IF=41.444）杂志上发表了题为“Demethylase ALKBH5 suppresses invasion of gastric cancer via PKMYT1 m6A modification”的研究性论文，该研究建立了一个ALKBH5-PKMYT1-IGF2BP3的转移调控系统，为胃癌转移提供了一个新的治疗靶点。诺禾致源在此承担m6A的测序工作。

研究背景 

研究表明，胃癌（gastric carcinoma，以下简称GC）的表观遗传变化与其侵袭和转移能力密切相关^[1-2]。已有研究报道：m6A 修饰参与包括GC在内的各种肿瘤的肿瘤进展过程^[3-5]，在GC研究中，大多数主要从甲基转移酶的角度研究了胃癌细胞侵袭和转移的机制^[6-8], 但对去甲基酶参与胃癌细胞侵袭和转移的具体分子机制尚未完全阐明。

研究思路

研究内容

1.MeRIP-seq：m6A修饰的基因与GC细胞粘附有很强的相关性；去甲基化酶ALKBH5下调与GC预后相关

GC组织的MeRIP-seq发现m6A信号主要出现在mRNA转录本的终止密码子和3'UTR附近（Peak在mRNA转录本功能区域上的分布），m6A修饰集中在GGACU基序上（Motif分析）。大多数在GC组织中表现出较高水平的m6A修饰（差异分析），GO分析表明这些基因主要富集在细胞-细胞粘附和上皮细胞迁移中（功能富集分析）。与此同时，这些基因的mRNA水平也明显高于邻近正常组织。（MeRIP-seq与mRNA关联分析）。（上述分析内容诺禾致源均可实现）

利用TCGA数据库（研究m6A 相关酶和迁移相关基因之间的相关性）、结合mRNA-seq数据以及对应的临床数据，发现ALKBH5在胃癌组织中表达明显降低，且与临床肿瘤远处转移和淋巴结转移有关。表明ALKBH5的低表达可能是胃癌转移的根源，可能是参与细胞迁移的关键去甲基化酶。

图1 MeRIP-seq揭示m6A与细胞黏附的相关性

2.ALKBH5体外功能研究：在体外抑制GC的侵袭和迁移

Transwell实验及伤口愈合实验发现过表达ALKBH5显著抑制了GC细胞的迁移能力，而干扰ALKBH5表达促进了GC细胞转移，进一步阐明m6A 去甲基化酶ALKBH5在细胞迁移中的作用，且这种作用与ALKBH5的去甲基酶活性密切相关

3.ALKBH5下游靶标基因的鉴定：PKMYT1

构建ALKBH5过表达细胞系，通过RNA-seq鉴定ALKBH5在GC转移过程中的潜在靶基因。在ALKBH5过表达细胞系中大部分与粘性相关的基因下调；结合MeRIP-seq筛选的GC组织中m6A 水平上调的基因，共筛选出237个共有基因。通过GEPIA数据库筛选GC组织中表达量上调的基因，结合已有文献以及MeRIP-qRT-PCR，最终筛选出ALKBH5的靶标基因PKMYT1（磷酸化蛋白激酶）。在SGC-7901细胞中，干扰ALKBH5 使PKMYT1的m6A 修饰水平和表达水平增加；过表达ALKBH5使PKMYT1的表达水平下降。RIP-seq和RNA pull down实验证明PKMYT1的转录本能够与ALKBH5结合。另外，组织微阵列（TMA）和TCGA数据库中的数据也证明GC组织中PKMYT1高表达，且与不良预后密切相关；细胞侵袭实验证明过表达/抑制PKMYT1可增强/减弱了GC细胞的转移能力，且过表达PKMYT1恢复了由于过表达ALKBH5导致的细胞转移能力的减弱，反之亦然。因此，PKMYT1作为ALKBH5的下游靶点，可以促进GC的侵袭和迁移。

图2 靶基因筛选过程

4.PKMYT1功能探究：以m6A依赖的方式促进GC的侵袭和迁移

使用SRAMP网站预测PKMYT1的mRNA序列中具有非常高置信度的五个潜在m6A 修饰位点并利用MeRIP-qPCR进行验证，结果表明：与正常组织相比，GC组织中两个位点的m6A 修饰水平显著升高，过表达ALKBH5导致这两个位点m6A 水平显著降低，而当ALKBH5脱甲基化酶活性的残基突变后它们的m6A 水平得到恢复。敲除ALKBH5后观察到相反的结果。由此表明PKMYT1 mRNA上的两个位点可能是ALKBH5调控的特定位点。GC组织的MeRIP-seq测序中IGV分析表明:与正常组织相比，GC中这两个位点的m6A 修饰水平明显更高；此外，PKMYT1在ALKBH5 H204A中明显下调。对两位点进行突变，突变后PKMYT1整体表达水平降低，GC转移能力显著降低。这种现象在ALKBH5敲低后更为明显。因此，研究认为PKMYT1以m6A 依赖的方式促进GC的入侵和迁移。

图3 ALKBH5通过其m6A依赖性方式调节PKMYT1

5.m6A阅读蛋白IGF2BP3通过其m6A修饰位点帮助维持PKMYT1 mRNA的稳定性

RNA pulldown实验和质谱分析确定了PKMYT1 m6A 修饰中潜在的阅读蛋白IGF2BP3（胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3），结合RIP-seq、组织微阵列和TCGA数据库分析验证发现IGF2BP3和PKMYT1在GC中的表达显著正相关，干扰IGF2BP3后，PKMYT1的表达显著降低。体外转录实验发现IGF2BP3与PKMYT1 mRNA的结合能力在两个PKMYT1 m6A 修饰位点突变后明显下降，表明IGF2BP3在维持PKMYT1 mRNA稳定性上的作用。

6.体内ALKBH5、PKMYT1与IGF2BP3的相关性研究

通过组织微阵列和TCGA数据库分析肿瘤远处转移组和淋巴结转移组中PKMYT1和IGF2BP3的表达情况：转移组IGF2BP3和PKMYT1表达明显高于未转移组；构建的裸鼠肿瘤肺转移模型，发现过表达ALKBH5使细胞形成肺转移的能力降低，肺组织切片HE染色显示转移性结节数量显著减少，免疫组化结果发现PKMYT1表达明显受到抑制。敲除ALKBH5后观察到相反的结果。

结论
研究确定ALKBH5是胃癌转移的肿瘤抑制因子，并且这种作用依赖于ALKBH5的去甲基化酶活性。PKMYT1是ALKBH5的下游靶基因且与ALKBH5表达呈负相关；PKMYT1经过m6A 修饰后，蛋白IGF2BP3通过识别其 m6A  修饰位点帮助增强 PKMYT1 的 mRNA 稳定性，导致其更高的表达水平，最终促进胃癌转移。

参考文献：

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