2022年6月22日，解放军总医院第五医学中心刘兵团队和北京大学人民医院黄晓军团队在Cell Discovery 杂志发表了题为Decoding lymphomyeloid divergence and immune hyporesponsiveness in G-CSF-primed human bone marrow by single-cell RNA-seq的研究论文。本研究首次在单细胞分辨率上对G-CSF刺激前后的人骨髓转录组图谱进行了解析，探究了G-CSF诱导骨髓造血分化偏倚和T/NK细胞免疫低反应性的潜在机制。该文章中的单细胞转录组测序服务由诺禾致源提供。

研究背景

异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是目前血液系统恶性肿瘤的有效治疗手段，但移植后合并症移植物抗宿主疾病（Graft-versus-host disease，GVHD）是造成移植后患者死亡的主要原因之一。粒细胞集落刺激因子 （granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF ）是临床上广泛应用的造血干细胞动员剂, 可通过免疫调节作用降低急性GVHD的发生率，而不影响移植物抗白血病效应 。此外，研究表明G-CSF动员的骨髓（G-BM）移植具有与G-CSF动员的外周血干细胞移植相当的植入效果和较低的GVHD风险，提示G-BM有独特的免疫调节特性。然而，迄今为止仍未精确解析G-CSF影响人骨髓造血分化及诱导免疫耐受的机制。

研究路线

主要结果

G-CSF治疗后人骨髓造血细胞的单细胞转录组学分析

为了生成G-BM中细胞的单细胞转录组图，在G-CSF处理5天前后分别从2名健康供体中收集了BM样本，并使用荧光激活细胞分选(FACS)分离不同的细胞系，经过严格的质量控制，从2个供体的4个BM样本中共获得21,005个细胞，并进一步划分为5个细胞系将其定义为HSPC，髓系，T/NK谱系，B谱系和红/巨核细胞系(EM_lineage)。并且发现，G-CSF治疗导致HSPC和髓系比例增加，而T/NK系比例下降，表明G-BM的造血偏向于髓系。骨髓造血相关基因LYZ、S100A8、S100A9表达增加，T细胞分化相关基因CD3D、TRAC、IFITM1表达降低也支持了这一发现。

G-BM的骨髓偏向造血分化

根据细胞类型相关基因的表达将鉴定出的HSPC重新聚类为9个亚群并且发现所有这些细胞在接受CSF刺激后细胞百分比均增加。进一步计算了HSPC中的相对细胞比例发现：人G-BM中同样存在淋髓造血分化的偏倚，即林系祖细胞包括共同淋系祖细胞（common lymphoid progenitor, CLP）和祖B细胞（progenitor B cell, Pro-B）的相对比例下调，而髓系祖细胞粒-单核祖细胞（granulocyte-monocyte progenitor，GMP）的比例显著上调，通过结合造血干祖细胞中细胞组成变化和淋髓分化轨迹分析，首次推测G-CSF诱导人骨髓造血淋髓偏倚最早发生在淋系倾向多潜能祖细胞（lymphoid-primed multipotent progenitor，LMPP）水平。

G-CSF给药前后BM中T/NK谱系亚聚类

为了进一步评估G-CSF对免疫细胞的影响，研究员分析了T细胞和NK细胞的数量。共鉴定出16个亚群其中包括6种CD4+ T细胞亚型、5种CD8+ T细胞亚型、2种NK细胞亚型、γδ T (γδ T)细胞、1型先天淋巴样细胞(ILC1)和3型先天淋巴样细胞(ILC3)样细胞。同时研究发现，G-BM中T亚群和NK亚群的百分比下降，这可能是由于骨髓细胞增加导致的。此外，T细胞和NK细胞表现出较高的迁移相关基因表达，可能导致了T/NK谱系百分比的降低。

G-BM中T/NK谱系的转录组变化和免疫调节作用的潜在直接机制
接下来，作者阐述了G-CSF对G-BM中T细胞和NK细胞转录组分析的影响。总体差异表达基因(DEG)分析显示，与免疫调节相关的基因表达上调。此外，基因评分分析显示CD4+ T细胞的免疫抑制评分显著升高，T/NK细胞的凋亡评分升高，进一步提示G-CSF诱导的免疫抑制特征。在G-CSF作用下，G-BM中的T和NK细胞一致表现出较高的免疫抑制相关基因表达。

结论研究

该研究分析了G-CSF动员前后人骨髓单细胞精度的转录组图谱，揭示了G-CSF刺激导致骨髓内造血分化淋髓偏倚的细胞层级，并深入解析了G-CSF通过直接和间接途径诱导T/NK细胞免疫低反应性的相关分子特征及潜在机制，为临床上治疗血液恶性肿瘤的HSCT策略优化及预防GVHD提供了重要线索。