发文单位：中国医学科学院/北京协和医学院张烜及杨华夏组

发文期刊：Nature communications

影响因子：16.6

发文日期：2024年3月7日

研究结果：本研究使用单细胞转录组测序对PD-1诱导的IA (PD-1-IA)、RA患者和健康个体的外周血、滑液(SF)中的CD45+细胞进行了分析，确定了与PD-1-IA相关的疾病特异性细胞群。发现IL1Bhi巨噬细胞和CD8+ Texs可能在PD-1-IA的发病机制中起着关键作用，为这种疾病提供了见解。其中本研究中单细胞转录组测序服务由诺禾致源提供。

背景介绍

炎程序性细胞死亡1（PD-1）抑制剂彻底改变了癌症的治疗。通过释放该免疫检查点建立的制动器，PD-1抑制剂激活抗肿瘤免疫，从而在越来越多的癌症类型的临床试验中取得了巨大的成功。然而，PD-1抑制剂对免疫系统的过度激活有时会对宿主组织造成损害，导致一系列免疫相关不良事件（irAE）。在irAE中，风湿性irAE在临床实践中越来越得到认可。最常见的风湿性irAE似乎是关节痛，发生于11.4 ~ 13.6%的接受免疫检查点抑制剂(ICI)联合治疗的患者。具体而言，发现大约一半的患者在ICI停止后持续存在炎症性关节炎（IA），中位随访时间为9个月。因此，迫切需要阐明PD-1-IA的发病机制，从而在不影响抗肿瘤疗效的前提下指导治疗方案。

主要结果

1.PD-1-IA患者、RA患者和HC患者的SFMCs和/或PBMCs的免疫景观

作者对全面表征活动性PD-1-IA 患者（IA_act，n = 5)和活动性血清阳性RA(n = 8)患者的滑液、外周血进行CD45+免疫细胞分选，分选后的细胞用于scRNA-seq。此外，从缓解期 PD-1-IA 患者（IA_rem患者，n = 5)和健康对照 （HCs，n = 8)的配对外周血中获得CD45+免疫细胞(图1a)。为了研究炎症关节的免疫细胞谱，在IA-act患者(n=3)和血清阳性RA患者(n=3)中进行了CD45+SFMC的scRNA-seq(图1a)。通过细胞定义，定义了9个主要细胞群(图1b)。IA_act和RA患者的SFMCs存在显著差异。与RA相比，IA_act中T细胞的比例显著增加，巨噬细胞、cDCs和S100B DCs的比例显著降低(图1c-d)。同样，对PBMCs进行细胞定义，共9种主要细胞类型(图1d)。除血小板外，其他类型细胞占比在四组中没有显著差异(图1e)。这些结果表明IA_act与滑液中T细胞和髓样细胞的主要变化有关，但与外周血中的变化无关。

图1 炎症性关节炎和类风湿性关节炎中CD45+细胞的免疫景观

2.  PD-1-IA滑液和外周血中IL1Bhi髓样细胞扩增

对SFMCs样本中髓系细胞群进行亚群定义，共定义到9个细胞亚群(图2a)。IA_act组的IL1B^hi巨噬细胞占比高，而RA组几乎没有这种巨噬细胞(图2a-e)。相反，RA组显著富含单核细胞样巨噬细胞和SPP1+巨噬细胞(图2c)。对PBMCs样本中髓系细胞群进行亚群定义，共定义到8个细胞亚群(图2f)，观察到两个IL1B^hi亚簇(IL1B^hi CD14+单核细胞和IL1B+ CD16+单核细胞)，几乎只存在于IA_act和IA_rem组(图2g-h)。与IA_act组相比，IA_rem组的IL1B表达显著降低(图2i)。IA_act组的IL1β+ CD14+单核细胞比例显著高于RA组、ICI-nonAE组和HC组(图2j-k)。

图2 IL1Bhi巨噬细胞/单核细胞可作为IA相关髓系细胞鉴定物

3. SFMCs中的IL1Bhi巨噬细胞与PBMC中的IL1Bhi单核细胞具有相似的炎症特征，并可能与PBMC相鉴别

SFMCs中的IL1B^hi巨噬细胞，与其他亚群相比，前10个差异高表达基因DEG是趋化因子(CXCL10、CCL3L1、CCL8)、干扰素诱导基因(IFIT2、IRF1、GBP1、GBP5)和与M1巨噬细胞表型相关的基因(APOBEC3A12、TNFSF1013、CALHM614)(图3a)。多种炎症途径在IL1B^hi巨噬细胞中显著上调，均被称为PD-1-IA相关炎症信号通路(图3B)。与其他簇相比，IA_act患者的SFMCs中的IL1B^hi巨噬细胞显著上调了所有IA相关的炎症通路，这表明了IL1B^hi簇的促炎致病作用。

PBMCs中IL1B^hi单核细胞的最显著DEGs是趋化因子(CXCL8、CCL3L1、IL1B、CCL4)(图3d)。GSEA分析表明，与IA相关的炎症通路在IL1B^hi单核细胞中也显著上调，其中，IL1B^hi CD14+单核细胞表现出最显著的TNF信号通路上调(图3e-f)。对SFMCs和PBMCs的单核细胞和巨噬细胞进行Monocle3轨迹分析(图3g-h)，IL1B^hi单核细胞和巨噬细胞形成了与其他簇不同的轨迹，表明了紧密的细胞过渡顺序紧密(图3i)。IL1B^hi细胞轨迹反映了外周血单核细胞到滑液促炎巨噬细胞的转变，其表型与M1巨噬细胞相似(图3j)。因此，作者认为SFMCs中的IL1B^hi巨噬细胞标记有炎症信号，并可能与PBMCs中的IL1B^hi单核细胞相区别。

图3 SFMCs中的IL1Bhi巨噬细胞标记有炎症信号，并可能与PBMCs中的IL1Bhi单核细胞相区别

4. PBMCs或SFMCs的IL1Bhi髓系细胞中，NLRP3炎症小体途径活性升高

IL1β 通常在NLRP3炎症小体激活后产生。在SFMCs中，IL1B三种信号的活性在IL1B^hi巨噬细胞中大多升高，与RA组相比，在IA_act组中显著富集(图4a-b)。NLRP3基因和IL1B基因的共表达，以及NLRP3炎症小体核心通路组分和IL1B基因的共表达，在单细胞转录组中具有显著性(图4c)。

同样，在PBMCs中，NLRP3炎性小体信号的活性在IL1B^hi单核细胞中升高，并且与RA组和HC组相比，IA组显著富集(图4d-e)。与IA_rem组相比，IA_act组中NLRP3炎症小体信号的活性升高(图4d)。NLRP3基因和IL1B基因的共表达，以及NLRP3炎症小体核心通路组分和IL1B基因的共表达，在单细胞转录组中具有显著性(图4f)。总之，这些结果表明NLRP3炎症小体通路在IL1B中的重要作用，IL1B^hi髓系细胞有作为PD-1-IA治疗靶点的潜力。

图4活化的NLRP3炎症小体信号是IL1Bhi髓系细胞的特征，治疗后下调

5.PD-1-IA患者SFMCs中CD8+ Tex数量增加

接下来，作者细致研究了滑膜T细胞和NK细胞。在12个明确的T/NK亚群中，5个是CD4+ T细胞亚群(CD4+中枢记忆T细胞[Tcms]、SELL+ CD4+ Tcms、CD4+效应记忆T细胞[Tems]、CD4+ Texs和CD4+调节T细胞[Tregs])，5个是CD8+ T细胞亚群(CD8+粘膜相关不变T细胞[MAITs]、CD8+ Tems、CD8+细胞毒性T细胞[CTLs]、CD8+ Texs和循环CD8+ T细胞)；与RA组相比，IA_act组表现出更高比例的CD8+ Texs、CD8+ Tems和CD4+ Tregs细胞，更低比例的 CD4+ Tems和CD4+ Texs细胞(图5c)。

鉴于CD8+Tex几乎只存在于IA_act患者的SFMC中，提取了IA_act组中SFMC来源的CD8+Tex，并将其进一步细分为4类(C1–C4)以探究其潜在的异质性(图5f)。有趣的是，CD8+ Tex-C1以终末耗竭标记物(PDCD1、ENTPD1、HAVCR2、TOX)的高表达为标志，而CD8+ Tex-C4以祖细胞耗竭标记物(PDCD1、TCF7、IL7R、SELL)的高表达为标志(图5g)。结果显示，CD8+ Tex-C4对祖细胞耗竭信号显示出显著更高的活性。相反，CD8+ Tex-C1在末端耗尽信号中显著富集(图5h)。

虽然循环CD8+ T细胞的细胞比例在IA_act组和RA组之间没有差异，但确定了两组之间循环CD8+ T细胞的不同衰竭状态，表明存在与IA_act相关的衰竭亚群(图5d)。因此，对循环CD8+ T进行亚群分析，分为4个不同的聚类(C1–C4)(图5i)。值得注意的是，与IA_act相关的CD8+ T循环-C3和CD8+ T循环-C4(图5j)，其终末衰竭信号的活性评分显著升高(图5k)。与CD8+ Tex-C1相似，CD8+ T循环-C4的特征是CXCL13、TOX、IFNG、CCL3和CCL4的高转录表达(图5l)，并表现出由MKI67表达指示的更强的增殖能力(图5m)。因此，自我更新的祖细胞耗尽的CD8 Texs（CD8 Tex-C4）和增殖的CD8 Texs（CD8 T cycling-C4）都可能促进PD-1-IA的发病机制。

图5 PD-1-IA患者SFMCs中CD8+ T细胞耗竭的异质性模式

6.IL1Bhi髓样细胞通过CCR1-CCL5/CCL3和CXCL10-CXCR3轴协调细胞通讯

通过细胞通讯分析表明，在滑液中，PD-1-IA组的髓样细胞与T细胞的相互作用比RA组强得多(图6a)。通常，在外周血中，PD-1-IA组中细胞因子/趋化因子和受体的相互作用对超过RA和HC组中的相互作用对，并且IA_act组中的数量略高于IA_rem组(图6b)。主要的细胞因子/趋化因子-受体对是CCR1-CCL5/CCL3和CXCL10-CXCR3(图6c)。作为CCL5和CCL3的受体，与RA和对照组相比，CCR1在IA_act的滑膜CD11b+巨噬细胞和外周CD14+单核细胞中的表达也更高(图6f–h)。体外趋化性试验证实，在CCL5治疗下，IA_act患者的外周单核细胞表现出跨孔迁移增加(图6i)。此外，在IA_act患者中观察到单核细胞向CD8+ T细胞的迁移增加，并且通过CCL5阻断减弱了这种增强的迁移(图6j-k)。因此，作者证明 CCR1-CCL5/CCL3 和 CXCL10-CXCR3 是PD-1-IA患者中 IL1B^hi 髓系细胞和CD8+ Texs之间的关键信号对。

图6 CD8+ Texs和IL1Bhi髓系细胞之间的串扰

结论

作者报告了对PD-1-IA患者、RA患者和健康个体的外周血和SF中免疫细胞的全面单细胞分析，确定了与PD-1-IA相关的疾病特异性细胞群。发现IL1Bhi巨噬细胞和CD8+ Texs可能在PD-1-IA的发病机制中起着关键作用，为这种疾病提供了见解(图7)。

图7 本研究的图形摘要