发文单位：南方医科大学基础医学院李专课题组

发表期刊：Nature Communications

发表时间：2024年3月15日

研究背景：造血干细胞（Hematopoietic stem cell, HSC）处于造血谱系的顶端，具有自我更新和多谱系分化能力，能贡献整个生命体的血液系统。胚胎主动脉-性腺-中肾（Aorta-gonad-mesonephros，AGM）区的主动脉内皮细胞通过内皮造血转化（Endothelial to hematopoietic transition，EHT）过程，经历I 型Pre-HSC和II 型Pre-HSC阶段成熟为功能性HSC。虽然HSC发育的调控已有不少报道，但因细胞数量稀少、识别分子的动态变化等特征，Pre-HSC成熟的调控机制尚未完全理解。此项研究揭示了细胞自噬在HSC产生过程中的生理作用，为HSC再生的阶段性调控提供了重要的理论支撑。诺禾致源提供了该文中单细胞转录组测序服务。

研究结果：

Atg5作为自噬的关键调节因子，通过使用Atg5条件敲除和自噬报告小鼠模型LC3^R/G，研究了自噬在造血发育中的调节作用。研究结果表明，Atg5对造血前体的形成/成熟和HSC功能至关重要。对Atg5敲除前后的AGM进行单细胞转录组测序表明，在Atg5缺失组中内皮细胞（EC）和造血细胞（HC）的百分比增加。

对内皮细胞和造血细胞进行亚群细分，发现了九个聚类亚群，包括静脉EC（C1-C2，vEC）、动脉EC（C3，aEC）、HEC（C4）、pre-HSC（C5）、髓样前体细胞（C6）、巨噬细胞（C7）、巨核细胞（C8）和红细胞（C9）。在KO组中vEC和aEC的细胞比例发生改变。同时，血管的免疫染色显示，与对照组相比，KO组主动脉的直径和面积减小。Atg5缺陷导致内皮细胞和造血细胞簇中HEC和pre-HSC的细胞比例增加，而成熟的造血细胞簇（C6-C8）减少。同时，成熟的造血细胞和HEC/pre-HSC中存在细胞周期的改变，流式分析证实pre-HSC II阶段处于细胞周期的活跃阶段，这暗示着EHT过程可能发生改变并影响造血细胞的成熟。

为了清晰地说明在Atg5 缺乏后 EHT 过程中的转录变化，将 vEC、aEC 和 pre-HSC进一步分离成十个亚群，在 KO 组中pre-HSC I 和 II 的百分比增加。Monocle 2轨迹分析揭示了Atg5 缺失导致 pre-HSC I 从 EC 到 pre-HSC 转变的积累。RNA 速度分析表明 Atg5 可能通过调节 Runx1、 Gfi1 和 Kit 的剪接状态促进 pre-HSC 发育的过程。这些数据揭示了自噬在调控 EHT 过程中可能的信号通路。

通过差异表达基因（DEGs）和基因本体生物过程（GOBP）分析表明KO 组中HECs富集基因的表达与受限的Smad蛋白磷酸化有关；pre-HSC I基因在细胞间黏附和血管发生过程中富集，pre HSC II在核分裂和血管生成过程中富集；pre HSC中p53信号通路和VEGF通路富集。因此，Atg5缺乏会改变与造血相关的生物过程。

由于Ncl是Mdk和Ptn的受体，Ptn/Mdk-Ncl的相互作用在KO HEC、pre HSC I和II细胞中得到增强，表明核仁可能参与造血过程。通过体外实验验证表明Atg5缺乏后，通过核仁途径影响EHT过程。

综上，该研究发现自噬在造血发育中发挥作用，特别是在造血前体细胞成熟为功能性HSC的过程中，并通过Ncl途径调节HEC的造血潜能和pre-HSC I的成熟，为HS/PC再生提供了潜在的调节因子。