翻译组Ribo-seq送样建议-诺禾致源

声明：
实验室不接收《人间传染的病原微生物名录》（点击查看）的所有样品。对于高毒性动植物等样品，必须事先通过销售、客服或运营经理与诺禾致源技术人员联系，确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
提取风险提示和注意事项：核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系，尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸，请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本，建议自行提取。取样过程中，需要全程佩戴手套，并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒，以免样本污染

1. 常见样本类型

客户分离的RPF(胶回收后的RNA)改为：客户分离的RPF(去除核糖体蛋白后的RNA片段)

2. 细胞类样本（不接未固定的细胞样本）

2.1 贴壁细胞

样本类型

送样量

保存/运输

备注

贴壁细胞

5×10⁶，细胞活性90%以上

冻存管分装后液氮速冻；-80℃保存，干冰运输

需放线菌酮固定

样本制备方法：
（1）培养贴壁细胞，细胞总量应为至少5×10⁶个。吸出培养基，加入新鲜培养基（含放线菌酮，终浓度0.1mg/ml），孵育1min；
（2）吸出培养基并将细胞置于冰上。用10ml预冷的PBS（含放线菌酮，终浓度在0.1mg/ml）轻轻冲洗一次，吸干液体；
（3）再加入1-2ml预冷的PBS（含放线菌酮，终浓度0.1mg/ml），侧拿皿使之一定程度倾斜，用一次性细胞刮刀轻轻刮下细胞，刮的时候顺一个方向转着刮，集于底侧；
（4）用1ml枪吸净置预冷1.5ml EP管内（一次吸不完可离心弃上清后再吸）；
（5）利用已预冷的4℃离心机收集细胞，500g离心5min，吸弃上清，收集细胞；
（6）液氮速冻。-80℃暂存，干冰运输。
放线菌酮为剧毒化合物，操作时注意做好防护，处理后残余物不要随意丢弃。

若需裂解，请按如下操作：
（1）所需试剂

试剂	储存条件
细胞培养液	4 ℃
PBS	4 ℃
Polysome Buffer	4 ℃
10% Triton X-100	-20 ℃
100 mM DTT	-20 ℃
DNase I（1U/μl）	-20 ℃
50 mg/ml cycloheximide	-20 ℃

（2）配置裂解液（每个样本 1ml），4℃预冷。

试剂	体积（μl）	储存条件
Polysome Buffer	878	4 ℃
10% Triton X-100	100	-20 ℃
100 mM DTT	10	-20 ℃
DNase I（1U/μl）	10	-20 ℃
50mg/ml cycloheximide	2	-20 ℃

（3）贴壁细胞裂解液制备
  1）培养贴壁细胞，细胞总量应为至少5×10⁶个。吸出培养基，加入新鲜培养基（含放线菌酮，终浓度0.1mg/ml），孵育1min。
  2）吸出培养基并将细胞置于冰上，用10ml 预冷的PBS（含放线菌酮，终浓度 0.1mg/ml）冲洗细胞。
  3）吸出并弃掉PBS，加入1ml裂解液至培养皿中使用细胞刮刀或者移液枪轻柔收集细胞，并将其转移至离心管中。
  4）冰上孵育10min，定时颠倒混匀。
  5）4°C，20000g 离心10min，将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
  6）使用裂解缓冲液校零后，测量裂解产物初浓度，初浓度≥500ng/μl，即可进行干冰送样。

注意事项：
（1）需要使用放线菌酮进行固定后冻存送样，若要裂解送样（需要使用裂解液，不接收研磨后的样品），裂解液浓度需≥500ng/μl，每个样本按照300μl/管进行分装，干冰送样。
（2）同时进行转录组测序的，请根据转录组送样要求另外准备样本。
（3）诺禾致源收到固定后的细胞样本，会用含放线菌酮的裂解液对其进行再次固定，时间为20min。

2.2 悬浮细胞

样本类型

送样量

保存/运输

备注

悬浮细胞

5×10⁶，细胞活性90%以上

冻存管分装后液氮速冻；-80℃保存，干冰运输

需放线菌酮固定

样本制备方法：
（1）取至少5×10⁶个细胞，500rpm离心5min，弃上清。
（2）加入新鲜培养基（含放线菌酮，终浓度0.1mg/ml），轻柔吹吸混匀，500rpm离心5min，弃上清。
（3）加入1ml预冷的PBS（含放线菌酮，终浓度0.1mg/ml），轻柔吹吸混匀，转移至预冷1.5ml EP管内，500rpm离心5min，弃上清。
（4）500g，4℃，离心5min，吸弃上清，收集细胞；
（5）液氮速冻。-80℃暂存，干冰运输。
放线菌酮为剧毒化合物，操作时注意做好防护，处理后残余物不要随意丢弃。

若需裂解，请按如下操作：
（1）所需试剂

试剂	储存条件
细胞培养液	4 ℃
PBS	4 ℃
Polysome Buffer	4 ℃
10% Triton X-100	-20 ℃
100 mM DTT	-20 ℃
DNase I（1U/μl）	-20 ℃
50mg/ml cycloheximide	-20 ℃

（2）配置裂解液（每个样本 1ml），4℃预冷。

试剂	体积（μl）	储存条件
Polysome Buffer	878	4 ℃
10% Triton X-100	100	-20 ℃
100 mM DTT	10	-20 ℃
DNase I（1U/μl）	10	-20 ℃
50mg/ml cycloheximide	2	-20 ℃

（3）悬浮细胞裂解液制备
1）取至少5×10⁶个细胞，800rpm离心5min，弃上清。
2）加入新鲜培养基（含放线菌酮，终浓度 0.1mg/m），轻柔吹吸混匀，800rpm离心5min，弃上清。
3）加入1ml预冷的 PBS（含放线菌酮，终浓度 0.1mg/ml），轻柔吹吸混匀，800rpm离心5min，弃上清。
4）加入1ml裂解液，轻柔吹吸混匀；后冰上孵育10min，定时颠倒混匀。
5）4°C，20000g离心10min，将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
6）使用裂解缓冲液校零后，测量裂解产物初浓度，初浓度≥500ng/μl，即可进行干冰送样。

注意事项：
（1）需要使用放线菌酮进行固定后冻存送样，若要裂解送样（需要使用裂解液，不接收研磨后的样品），裂解液浓度需≥500ng/μl，每个样本按照300μl/管进行分装，干冰送样。
（2）同时进行转录组测序的，请根据转录组送样要求另外准备样本。
（3）诺禾致源收到固定后的细胞样本，会用含放线菌酮的裂解液对其进行再次固定，时间为20min。

3. 动物组织

样本类型

送样量

保存/运输

备注

动物组织

≥300mg

冰上分割小块，分管备份；液氮速冻，-80℃保存，干冰运输

选用新鲜采集的样本，优先选择核酸含量高的部位，冰上取样，建议送备份

样本制备方法：
（1）动物组织取材后用预冷的RNase-free水冲洗，去除血渍和污物，并剔除非研究所需的组织，吸干水渍；
（2）冰上操作，将组织切小块（厚度小于0.5cm），放入已标记好的旋盖冻存管中，迅速浸入液氮中速冻至少1h，然后保存于-80℃冰箱，以避免实验操作前样本降解；干冰运输。
（3）为确保实验的顺利，建议样本备份1-2份，每份至少＞300mg，以防部分样品降解重新取材，制备或送样。

动物组织裂解（建议送组织，如送裂解产物需按如下流程获得）：
（1）所需试剂

试剂	储存条件
Polysome Buffer	4 ℃
10% Triton X-100	-20 ℃
100 mM DTT	-20 ℃
DNase I（1U/μl）	-20 ℃
50mg/ml cycloheximide	-20 ℃

（2）配置裂解液（每个样本 1ml），4℃预冷。

试剂	体积（μl）	储存条件
Polysome Buffer	878	4 ℃
10% Triton X-100	100	-20 ℃
100 mM DTT	10	-20 ℃
DNase I（1U/μl）	10	-20 ℃
50mg/ml cycloheximide	2	-20 ℃

（3）动物组织裂解液制备
1）取0.3g 动物组织，液氮充分研磨至粉末状（一定要研磨充分，利于后期的裂解）。
2）研钵中加入2ml的裂解液，轻柔吹打，用移液枪将裂解液转移至离心管中。
3）冰上孵育10min，并定时颠倒混匀。
4）4°C，20000g离心10min，将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
5）使用裂解缓冲液校零后，测量裂解产物初浓度，初浓度≥500ng/μl，即可进行干冰送样
注：裂解前超纯水快速清洗组织2次。

注意事项：
（1）组织样本裂解前，需使用超纯净水快速冲洗2遍；
（2）组织样本建议直接冻存送样：取新鲜组织，每个样本按照0.3g/管，切块后液氮淬灭，分装，干冰送样；
（3）裂解送样（需要使用裂解液，不接收研磨后的样品），裂解液浓度需≥500ng/μl，每个样本按照300μl/管进行分装，干冰送样。
（4）若为多组织取样，优先取易降解组织（肝/脾/胰脏等），每单个组织取完样，应立刻液氮速冻保存！
（5）同时进行转录组测序的，请根据转录组送样要求另外准备样本。

4. 植物组织

样本类型

送样量

保存/运输

备注

植物组织

≥300mg

冰上分割小块，分管备份；液氮速冻，-80℃保存，干冰运输

选用新鲜采集的样本，优先选择核酸含量高的幼嫩部位，建议送备份

样本制备方法：
（1）从植物体上取下研究所需的新鲜幼嫩、生长旺盛的组织，用预冷的RNase-free水将材料表面的灰尘或泥土冲洗干净，吸干；
（2）若组织体积较大，应在冰上将其切成小块或者薄片，放入2ml或者更大体积的旋盖冻存管中，标记好样本名称；
（3）迅速浸入液氮中速冻至少1h，保存于-80℃冰箱，以避免实验操作前样本降解；干冰运输。
（4）为确保实验的顺利，建议样本备份1-2份，每份至少＞300mg，以防部分样品降解重新取材，制备或送样。

若需裂解，请按如下操作：（建议送组织，如送裂解产物需按如下流程获得）
（1）植物组织 polysome buffer 配方

试剂	储存条件
Tris-Cl pH 7.5	50mM
KCl	0.2mM
MgCl₂	15mM

（2）所需试剂

试剂	储存条件
Polysome Buffer	4 ℃
10% Triton X-100	-20 ℃
β-巯基乙醇(20mM）	-20 ℃
DNase I（1U/μl）	-20 ℃
50mg/ml cycloheximide	-20 ℃

（3）配置裂解液（每个样本 1ml），4℃预冷。

试剂	体积（μl）	储存条件
Polysome Buffer	878	4 ℃
10% Triton X-100	100	-20 ℃
100 mM DTT	10	-20 ℃
DNase I（1U/μl）	10	-20 ℃
50mg/ml cycloheximide	2	-20 ℃

（4）植物组织裂解液制备
  1）取0.3g植物组织，液氮充分研磨至粉末状(一定要研磨充分，以利于后期裂解）。
  2）研钵中加入2ml裂解液，轻柔吹打，用移液枪将裂解液转移至离心管中。
  3）冰上孵育10min，定时颠倒混匀。
  4）4°C，20000g 离心10min，将上清液转移至冰上预冷的新离心管中。
  5）使用裂解缓冲液校零后，测量裂解产物初浓度，初浓度≥500ng/μl，即可进行干冰送样。
注：裂解前用超纯水快速漂洗组织2次。

注意事项：
（1）在取样前，请使用超纯净水冲洗，保证无泥土等杂质污染；
（2）植物组织建议直接冻存，分装，用锡箔纸包裹，干冰送样；
（3）裂解送样（需要使用裂解液，不接收研磨后的样品），裂解液浓度需≥ 500ng/μl，每个样本按照300μl/管进行分装，干冰送样；
（4）同时进行转录组测序的，请按照转录组送样要求另外准备样本。

5. 其他样本类型

样本类型	送样量	保存/运输	备注
RPFs	≥200ng/μl，5μl以上	液氮速冻，-80℃保存，干冰运输	过柱法、蔗糖梯度离心收集或其他方式。

6. 注意事项

Ribo-seq同时做转录组建库，请另外按照转录组送样要求进行样本的准备，不可使用同一管样本建库。
细胞与动物组织 polysome buffer 配方

试剂	浓度
Tris-Cl pH 7.5	20mM
NaCl	150mM
MgCl₂	5mM
DTT	1mM

7 样本打包及寄送建议

7.1 样本的打包
（1）核酸样品建议使用质量好的1.5ml或2ml 低吸附EP管装载样品，并用封口膜封口。为了防止样品管破裂，或者污染和混乱，请不要使用诸如PCR管、0.5ml EP管、八联管、96孔板、深孔板等非标准管送样。非标准管不利于样品保存以及后续实验的进行。如有样品使用非标准管制备，还请在送样前自行转管处理。
（2）组织样本建议根据送样量使用合适规格带螺纹帽的EP管、冻存管或者离心管装载组织样品，并用封口膜封口。
（3）为防止样品管在运输过程中受到干冰挤压破裂，最好将样品管放到50ml离心管或其他支撑物中，并在支撑物里添加棉花或卫生纸缓冲。大量样品建议将EP管放置在冻存盒中，并在冻存盒外面包裹气泡垫。如使用锡箔纸、自封袋装载的样品，为防止运输中受挤压破损，建议将锡箔纸折叠整齐装在自封袋中，在样品包装外再用气泡垫包好并固定。
（4）对于血液样品，建议采用5-10ml 塑料抗凝采血管装载，为了防止运输过程中采血管因挤压而损坏，需要将每支采血管管身均用气泡垫包好，然后放置到塑料或纸质包装盒中。
（5）用乙醇沉淀的样品由于运输中会有少量乙醇挥发出，建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈。
（6）为便于处理和保存，组织样品送样量请不要超过建议送样量的5倍（特殊的得率较低的样品除外）。
7.2 样本的名称标识
（1）所有的样品必须具有清晰的标记，并且简洁明了。
（2）使用锡箔纸包装的组织样品建议在锡箔纸内外均标记样品名称，并将锡箔纸放在自封袋中，自封袋外面再标记上样品名称，防止锡箔纸上样品名称模糊引起样品混乱。
（3）使用乙醇沉淀的核酸样品，由于挥发出的乙醇会使记号笔的标记模糊，建议用油性记号笔将样品名称写在标签纸上，然后用透明胶带将标签纸粘贴在样品管壁上，并缠绕2-3圈。
（4）样品名称建议使用“字母+数字”命名方式标注在管盖。其他信息如日期、浓度、物种等可标注在管壁。所有标注内容需与《样品信息单》保持一致。