外泌体非编码RNA测序送样建议-诺禾致源

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外泌体非编码RNA测序

1 血浆/血清样品
2 细胞上清样品
3 尿液样品
4 其他常见样品
5 自提外泌体样品
6 外泌体RNA送样量
7 样本测序送样量和鉴定量汇总
8. 注意事项

声明：
实验室不接收《人间传染的病原微生物名录》（点击查看）的所有样品。对于高毒性动植物等样品，必须事先通过销售、客服或运营经理与诺禾致源技术人员联系，确定无高致病性和传染性后才能寄送样品。
提取风险提示和注意事项：核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系，尤其是三代超长提取对样本的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸，请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本，建议自行提取。取样过程中，需要全程佩戴手套，并且使用预冷乙醇对取样器材进行擦拭消毒，以免样本污染。

1 血浆/血清样品

样本类型	送样量/库	样本保存和运输
血浆/血清	4-5 ml	寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中，防止样本运输过程中被破坏；液氮速冻，干冰运输。
血浆样品样本制备方法：（1）用含有EDTA（紫头管）的5ml采血管抽取全血，共需10ml。轻柔上下颠倒混匀（离心条件限制时可将全血样本置于4°C保存，1h内进行下一步处理）；（2）4°C，使用吊桶式转头1900g离心10min，小心吸取上清即为血浆，最后500μl丢弃；（3）得到的血浆再次离心，在4°C，3000g的条件下离心15min，小心吸出血浆，注意不要碰到底部和侧面的沉淀物；（4）将血浆分装到EP管中，送样前可冻存于-80°C，避免反复冻融；注意：统一早晨空腹采血，尽量避免样本间的差异影响；不能用肝素抗凝管，因为肝素会影响后续的酶反应。
血清样本制备方法：（1）采用采血针和普通血清管（不含抗凝剂的5ml采血管（红头管））采血10ml；（2）室温静置30min后,然后4°C下静置3-4h（此时可见血块析出）；（3）用移液器吸取上面的淡黄色血清（应该有4ml左右）转入15ml离心管中，4°C条件下3000g离心15min，小心取上清转入新的15ml离心管中，最大程度保证血清质量；（4）离心后的血清15min内冻存于-80°C冰箱，避免反复冻融。
注意事项：（1）分离exosomes前，不能加入任何RNA保护剂（如Trizol，RNA later）；（2）若非研究血小板来源外泌体，请尽量采用血浆送样；（3）统一早晨空腹采血，尽量避免样本间的差异影响；（4）采血后避免剧烈振荡，防止溶血，溶血后需重新采样；（5）全血不可冻融，取血后尽早制备血浆/血清；（6）不能用肝素抗凝管，因为肝素会影响后续的酶反应。

2 细胞上清样品

样本类型	送样量/库	样本保存和运输
细胞上清	30ml	寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中，防止样本运输过程中被破坏；液氮速冻，干冰运输。
细胞上清本制备方法：（1）细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间，贴壁细胞密度在70%-80%（相对于培养皿的面积，长满为100%，肉眼判断），悬浮细胞密度在60%-70%（相对最大浓度来说，具体依据经验判断）；（2）贴壁细胞要去除原有培养基，换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基培养；悬浮细胞在300g，4°C的条件下离心10min收集细胞；（3）使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养。细胞继续培养24-48h，根据细胞的生长速度确定收取上清时间细胞上清收集时间（培养基变黄可能培养的时间太长）；（4）收集细胞上清，300g，4°C，离心10min；小心吸取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片；（5）3000g，4°C，再次离心15min，确保将细胞或者细胞碎片去除干净；（6）取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片，合并相同的细胞培养液上清样品，装入50ml离心管中，可在4°C短期保存（1-2天），长期保存可冻存于-80°C。
注意事项：（1）细胞培养基必须使用去除外泌体的血清或者无血清培养基；（2）细胞无衣原体、支原体及其他微生物污染，否则可能影响后续数据质量。请送样前确认本样本无微生物污染。若无法确认，公司提供支原体衣原体检测服务；（3）如果提供的是冻存细胞株，需提供详尽的复苏方法。（4）细胞上清分离后尽快进行外泌体分离，保存在4°C和-80°C，都会对外泌体形态质量有一定的影响。

3 尿液样品

样本类型	送样量/库	样本保存和运输
尿液	30ml	寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中，防止样本运输过程中被破坏；液氮速冻，干冰运输。
尿液样品制备方法：（1）采集前/中后段晨尿，应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液，并注意避免细菌污染，收集前注意饮食控制，于4°C临时保存（不超过8h）；（2）用15ml或50ml离心管收集尿液，300g，4°C离心10min，将上清转移至干净离心管中，避免碰触底部沉淀；（3）3000g，4°C离心15min，去除细胞或细胞碎片，保留上清，避免碰触到底部沉淀；送样前可冻存于-80°C，避免反复冻融。
注意事项：（1）收集尿液时，应该尽量选择受试者的“新鲜”尿液；（2）采集晨尿，或6 h以上未排尿亦可；无其他微生物污染。

4 其他常见样品

样本类型	送样量/库	样本保存和运输	注意事项
胸水/腹水	40ml	寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中，防止样本运输过程中被破坏；液氮速冻，干冰运输。	请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集脑脊液。
脑脊液	20ml
胆汁	15ml
胸水样本制备方法：（1）临床收集胸水后若不能第一时间处理，请于4°C临时保存（不得超过8h）；（2）将收集到的胸水1000g离心10min，收集上清液；（3）将得到的胸水上清3000g离心10min，收集上清，-80°C保存。
腹水样本制备方法：（1）临床收集腹水后若不能第一时间处理，请于4°C临时保存（不得超过8h）；（2）将采集的腹水在4°C下（室温亦可）离心2000g，20min，去除腹水残渣；-80°C保存。
脑脊液样本制备方法：（1）收集脑脊液10ml（请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集脑脊液），避免受到血液污染；采集方式为腰椎穿刺，样本一经分离，请务必立即置于冰上或4℃短暂保存（不得超过4h）,避免受到血液污染,勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放；（2）样本室温下3000g离心15min去除细胞及部分碎片，取上清，-80°C保存。
胆汁样本制备方法：（1）用无菌容器收集胆汁；（2）将收集到的胆汁在4℃下，3000g离心10min去除细胞沉渣和碎片；（3）收集胆汁上清液，4℃或者-20℃长期保存。

5 自提外泌体样品

样本类型	送样量/库	样本保存和运输	注意事项
自提外泌体	体积不超过200μl，粒径浓度要在1×10⁹个/ml以上或者BCA测定蛋白量在30-40μg以上。	加入≤200μl RNase-free的PBS并充分混匀或送沉淀。液氮速冻，干冰运输。	自行富集的外泌体可接外泌体鉴定，但可能存在无法鉴定为外泌体的情况。

6 外泌体RNA送样量

样本类型	送样量/库	样本保存和运输	注意事项
smallRNA	送样量>10ng，Aligent 2100检测在25-200nt长度范围有峰。	收集于EP管中，液氮速冻，干冰送样。	若送提取好的RNA，以高灵敏安捷伦2100检测为准。
ncRNA	送样量>5 ng， 2100 检测在 80-200 nt 长度范围有峰，大于 2000 nt 无峰，且 FU>10。	收集于EP管中，液氮速冻，干冰送样。	若送提取好的RNA，以高灵敏安捷伦2100检测为准。
注意事项：若用qubit定量结果要在150ng以上（原因：nanodrop检测结果偏高）；若用分光光度计由于超过检测最低下限因此不具有参考意义，至少要200ng以上。

7 样本测序送样量和鉴定量汇总

样本来源	电镜	粒径		表面标志蛋白检测/指标		测序量
样本来源	TEM	NTA	纳米流式	WB	纳米流式	送样量
外泌体	10μl	10μl	10μl	20μl	10μl	≤200μl，≥10⁹个/ml
血清/血浆	1ml	1ml	0.5ml	1ml	0.5ml	4-5ml
细胞上清	5ml	5ml	5ml	10ml	5ml	30ml
尿液	5ml	5ml	5ml	10ml	5ml	30ml
唾液*	0.5ml	0.5ml	0.5ml	1ml	0.5ml	10ml
脑脊液	1.5ml	1.5ml	1.5ml	3ml	1.5ml	20ml
羊水	5ml	5ml	5ml	10ml	5ml	50ml
精液*	1ml	1ml	1ml	1ml	1ml	15ml
胆汁	1ml	1ml	1ml	1ml	1ml	15ml
胸/腹水	2ml	2ml	2ml	4ml	2ml	40ml
乳汁*	2ml	2ml	2ml	4ml	2ml	50ml
卵泡液*	2ml	2ml	2ml	4ml	2ml	50ml
注意事项：（1）*为非常见样本，送样前请先与技术/产品经理确认。（2）其他类型或不常见样本请单独咨询产品线；（3）关于鉴定：因为蛋白检测需要进行单独的蛋白孵育，因此粒径检测的纳米流式和用于蛋白检测的纳米流式并非同时进行。在送样时如果需要用流式做粒径和蛋白检测，需要按照上表各自的量准备。

8 注意事项

（1）细胞上清进行外泌体lncRNA测序项目前，需提前评估；
（2）自提外泌体类型样本，均为风险样本；
（3）细胞培养基必须使用去除exosome（de-exosome）的血清或者无血清培养基（例如ThermoFisher的SFM）；
（4）分离外泌体前的样品不能加入任何RNA保护剂（如Trizol/RNAlater）；
（5）不建议自行富集外泌体，增大项目风险且不利于排查流转；建议直接送原样本；若自行富集外泌体，建议提取完核酸后送样；
（6）离心管在放入冰箱前，用封口膜密封；储存条件以及储存时间影响外泌体得率，保存在-80℃冰箱中的样本，如果储存时间过长，外泌体产量也会显著降低；
（7）全血建议使用PAXgene管保存，不可冻融，取血后尽早制备血浆或血清，血浆或血清可以-80°C保存，避免反复冻融；
（8）不接只做鉴定的样本服务。