环状RNA（circRNA）是一种新发现的内源性非编码RNA，具有高稳定性、丰度和保守性等特点，其研究应用方向不仅仅局限于癌症、肿瘤等疾病研究，也逐渐延伸到生物体的生长发育和代谢调控等领域。本期circRNA项目文章分享，是山东大学齐鲁医院神经外科脑科学实验室李刚教授及薛皓教授共同通讯于2022年1月14日在Molecular Cancer（IF=27）发表题为“EWSR1-induced circNEIL3 promotes glioma progression and exosome-mediated macrophage immunosuppressive polarization via stabilizing IGF2BP3[1]”的研究论文，旨在研究circRNA 在促进胶质瘤发生、恶性进展和巨噬细胞肿瘤促进表型极化方面发挥的多方面作用。诺禾致源提供circRNA建库测序分析专业服务。

摘要

胶质瘤是最常见的恶性原发性脑肿瘤，具有高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）和不良预后。环状RNA（circRNA）是一种新发现的内源性非编码RNA，具有高度稳定性、丰度和保守性，在各种肿瘤的病理生理过程和TME重塑中发挥着重要作用。本研究进行circRNA测序分析以探索circRNA在正常和胶质瘤组织中的表达谱。一种新的circRNA，即circNEIL3，在脑胶质瘤发展中的生物学功能已在体外和体内得到证实。在机理上，进行了RNA下拉、质谱、RNA免疫沉淀（RIP）、荧光素酶报告和共免疫沉淀分析。最终研究结果表明，circNEIL3在促进胶质瘤发生、恶性进展和巨噬细胞肿瘤促进表型分化方面发挥着不可忽视的多方面作用，circNEIL3是胶质瘤的潜在预后生物标志物和治疗靶点。 

背景

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种脑胶质瘤，WHO等级为IV级，恶性程度最高[1.2]。即使主动手术联合放化疗，胶质瘤的治疗效果仍然较差。因此，阐明胶质瘤进展的分子机制以改善患者的预后非常重要。同时胶质瘤相关信号异常的影响不仅限于癌细胞，而是扩展到与肿瘤微环境（TME）相互作用的复杂网络。胶质瘤TME的功能和组成受肿瘤细胞内在信号通路和分泌因子的影响。反过来，TME中的细胞可以通过调节多种肿瘤生物学特性来维持癌症特征，包括细胞增殖、存活、迁移和免疫逃逸。越来越多的证据表明，circRNA参与了TME的多方面调节。然而，到目前为止，关于circRNA调节胶质瘤中TAM的机制仍不清楚，了解神经胶质瘤和TAM之间的多方面联系可以开辟新的治疗途径。

材料与方法

实验材料：39例胶质瘤组织（11例多形性胶质母细胞瘤（GBM）病例和28例低度胶质瘤（LGG）病例）；8例正常脑组织（NBT）；胶质瘤细胞系（A172和U251）

测序方法：circRNA-seq

测序平台：Illumina Novaseq-6000；PE150

实验方法：qRT-PCR；慢病毒、siRNA、质粒构建和细胞转染；CCK-8；蛋白质印迹检测；共免疫沉淀；RIP；RNA下拉检测；免疫荧光；免疫组化等

重要结果

1.脑胶质瘤组织中 circneil3明显升高

为了确定参与胶质瘤发生和进展的潜在致癌circRNA，我们使用circRNA测序分析了39例胶质瘤组织和8例正常脑组织中circRNA的表达谱。火山图显示了GBM和LGG之间以及LGG和NBT之间circRNA表达的系统性差异，进一步分析了胶质瘤组织中差异上调的circRNA，并确定了hsa_circ_0001460，这是唯一一个随着胶质瘤分级增加而上调的circRNA（图1C）。作者将hsa_circ_0001460命名为circNEIL3，它由NEIL3生成。与NBT相比，circNEIL3在胶质瘤组织中显著上调，其表达随着胶质瘤分级的增加而增加（图1D）。ROC曲线表明circNEIL3可以预测胶质瘤患者的不良预后（图1E）。总之，这些结果表明circNEIL3在胶质瘤组织中显著上调，在GBM中表达最高，表明它参与了胶质瘤的肿瘤发生和恶性进展。

图1

2.circNEIL3在体外和体内促进了胶质瘤的发生

为了研究circNEIL3在胶质瘤进展中的潜在生物学作用，根据转录组测序数据，对与circNEIL3表达显著正相关的基因进行了KEGG富集分析。这些基因在参与肿瘤发病机制的许多途径中显著富集，包括细胞增殖调节途径、与肿瘤侵袭和迁移相关的途径，以及参与肿瘤发生的经典信号通路，包括p53信号通路和癌症中的信号通路（图2A）。GSEA分析结果还显示，这些通路在高circNEIL3表达组中显著富集（图2B）。此外，单样本GSEA（ssGSEA）算法结果表明与低表达circNEIL3组相比，高表达组在致癌信号通路中更明显地富集（图2C）。由于circNEIL3可能参与细胞增殖、侵袭和迁移，作者进一步研究了circNEIL3在细胞行为中的功能。与生物信息学分析结果一致，证实circNEIL3的下调显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭（图3）。综上所述的数据表明circNEIL3在调节肿瘤发生和胶质瘤进展方面具有重要的功能。

图2

图3

3.EWSR1促进脑胶质瘤中circNEIL3的生物发生

circRNA的环化机制受RNA结合蛋白（RBPs）的调节，RBPs结合到前mRNA的上游和下游区域。作者使用CircInteractome数据库和starBase 3.0数据库预测了在circNEIL3的上游和下游区域中的三个EWSR1结合位点，称为序列1、序列2和序列3（图4A）。结果发现，EWSR1的表达水平随着胶质瘤的分级而增加，高表达的EWSR1患者的预后比低表达的患者差（图4B）。此外，作者还验证了敲除EWSR1可以抑制GBM细胞增殖、侵袭和迁移（图4C、D）。同时发现circNEIL3与EWSR1正相关（图4E），并且在EWSR敲除的U251和A172细胞中circNEIL3的表达显著降低（图4F）。有研究表明，EWSR1在缺氧环境中可能更活跃。因此将U251和A172细胞置于缺氧条件下0 h、 6h、 12h和24 h、 随着暴露时间的增加，EWSR1和circNEIL3的表达上调（图4G、H）。RIP-qPCR分析证实，EWSR1可以与NEIL3前体mRNA的序列1和序列3结合，并且在缺氧条件下结合能力显著上调（图4I）。这些数据表明，EWSR1可以使circNEIL3循环，并且在缺氧条件下，这个过程更加活跃。

图4

4.CircNEIL3与IGF2BP3发生物理相互作用，并抑制泛素/蛋白酶体介导的IGF2BP3降解

研究表明，细胞质保留的圆环RNA通常通过充当RBP的ceRNAs或支架来发挥其功能[5,6]。为了探索circNEIL3诱导GBM细胞进展的分子机制，首先进行了RNA下拉分析和质谱分析，然后将质谱数据与CircInteractome数据库中预测的RBPs进行交叉发现circNEIL3与IGF2BP3蛋白结合（图5A）。接着通过RNA下拉和RIP qPCR分析进一步证实了circNEIL3和IGF2BP3之间的相互作用（图5B、C）。最后还进行了RNA-FISH免疫荧光（FISH-IF）分析，发现circNEIL3在细胞质中与IGF2BP3共定位（图5D）。同时作者发现在TCGA和CGGA数据集中，IGF2BP3的表达水平随着肿瘤分级而增加并且促癌信号通路显著丰富。之后实验结果表明circNEIL3并没有显著改变IGF2BP3的mRNA水平，但显著促进其蛋白表达以及其下游靶点的表达，参与细胞增殖、侵袭和迁移的生物学功能。这表明circNEIL3可能通过破坏IGF2BP3蛋白的稳定性来调节胶质瘤的恶性进展。最终通过进一步研究以及数据库预测发现，circNEIL3通过抑制泛素/蛋白酶体依赖性降解增强了IGF2BP3蛋白的稳定性，从而促进了胶质瘤的恶性进展。

图5

5.CircNEIL3促进胶质瘤中的巨噬细胞浸润

最近的证据表明，胶质瘤细胞可以向TME募集免疫细胞，从而维持胶质瘤病理学并促进恶性进展。为了进一步了解circNEIL3在胶质瘤免疫表型中的确切作用，研究者使用估计算法评估了胶质瘤纯度、基质和免疫评分，并通过GSVA算法分析了代表不同免疫细胞类型、功能和途径的31个基因集。结果如图6A，与circNEIL3低表达组相比，circNEIL3高表达组的TME细胞浸润更大，免疫和基质评分更高，肿瘤纯度更低。与低表达circNEIL3的胶质瘤相比，高表达circNEIL3的胶质瘤表现出显著增加的巨噬细胞浸润，这构成了胶质瘤TME中最丰富的细胞群。为了进一步证实circNEIL3在促进巨噬细胞迁移中的作用，使用Transwell分析发现，与NC组相比，来自circNEIL3过度表达的GBM细胞的条件培养基（CM）显著促进THP1分化的巨噬细胞迁移（图6B），而来自circNEIL3敲除GBM细胞的CM显示出相反的结果（图6C）。综上所述，结果表明circNEIL3过表达的肿瘤细胞可以促使巨噬细胞浸润到胶质瘤微环境中。

图6

6.CircNEIL3可通过hnRNPA2B1包装成外泌体

过去的研究表明，circRNA可以被包装成外显体，并在肿瘤的进展中发挥重要作用。首先作者成功地从GBM细胞中分离出外泌体，接着发现在GBM细胞中circNEIL3的过度表达导致外显体中circNEIL3表达水平的增加，而在同一细胞系中circNEIL3的敲除产生相反的结果，这些结果表明circNEIL3可以被包装成外泌体。接下来还研究了circNEIL3被包装成外泌体的机制。首先通过circNEIL3下拉实验的质谱数据发现circNEIL3可以与hnRNPA2B1结合，hnRNPA2B1可以将各种RNA运输到外泌体。然后在GBM细胞中通过RIP和RNA下拉分析确认circNEIL3和hnRNPA2B1之间的相互作用（图7A，B）。此外，发现在hnRNPA2B1敲除的GBM细胞中，circNEIL3表达在细胞中上调，在外泌体中下调（图7C）。总之，这些结果表明，hnRNPA2B1可以将circNEIL3包装成外质体。

图7

7.外泌体将circNEIL3传递给TAMs，从而使它们能够通过稳定IGF2BP3获得免疫抑制特性

外泌体在癌细胞和TAM之间的通讯中起着至关重要的作用，我们从正常表达、过度表达或敲除circNEIL3的GBM细胞中收集外泌体，并将其分为高、中、低表达组，然后使用它们治疗THP1分化的巨噬细胞，结果表明外泌体可以将circNEIL3传递给TAM，从而使它们获得血管生成和免疫抑制特性。为了进一步验证circNEIL3对体内巨噬细胞免疫抑制极化的影响，将过度表达circNEIL3或阴性对照载体的巨噬细胞与胶质瘤细胞原位共植入裸鼠脑内，结果表明IGF2BP3可以作为巨噬细胞中circNEIL3的下游效应器，使其获得免疫抑制特性，进而促进胶质瘤的进展。

结论

总之，本研究发现了一种新的环状RNA，circNEIL3，它在人脑胶质瘤组织中上调。受EWSR1调控的circNEIL3的表达随着胶质瘤分级的增加而增加。在功能上，作者证实circNEIL3在体外和体内促进了肿瘤的发生和胶质瘤的进展。在机制上，circNEIL3通过阻止Hect4介导的泛素化来稳定已知致癌蛋白IGF2BP3。此外，circNEIL3过度表达的胶质瘤细胞可促使巨噬细胞浸润TME。最后，circNEIL3可以被hnRNPA2B1包装成外质体，并传递给浸润性TAM，从而使它们能够通过稳定IGF2BP3获得免疫抑制特性，进而促进胶质瘤生成和恶性进展。研究结果表明，circNEIL3可能是一种新的预后生物标志物，并有望成为胶质瘤的治疗靶点。  

思路总结

参考文献

[1] Pan Z, Zhao R, Li B, et al. EWSR1-induced circNEIL3 promotes glioma progression and exosome-mediated macrophage immunosuppressive polarization via stabilizing IGF2BP3. Mol Cancer. 2022;21(1):16. Published 2022 Jan 14. doi:10.1186/s12943-021-01485-6