背景

肝内胆管癌（ICC）易转移且术后复发迅速，预后较差。肿瘤微环境中IL-6（白细胞介素）的异常表达使STAT3磷酸化并转移到细胞核中调控下游靶基因的转录，促进肿瘤细胞生长和转移，且IL-6可以诱导非编码RNA表达促进肿瘤侵袭。具有分子海绵作用的环状RNA（circRNA）作为非编码RNA，部分具有内部核糖体进入位点（IRES），可以招募核糖体诱导蛋白质翻译，是癌症发生和转移的重要标志物。然而，IL-6调控circRNAs等其他机制是否促进肿瘤的发生尚不清楚。来自四川大学华西医院吴泓、曾勇、袁克非课题组，中山大学附属第三医院汪根树课题组在影响因子为17.421的Hepatology杂志上发表文章题目为“IL-6 induced cGGNBP2 encodes a novel protein to promote cell growth and metastasis in intrahepatic cholangiocarcinoma”的研究成果，报道了一种IL-6诱导的circRNA（cGGNBP2），并对其编码的新型蛋白（cGGNBP2-184aa）进行了表征，研究了cGGNBP2-184aa在IL-6/STAT3信号传导和ICC转移中的作用。诺禾致源在此提供专业的circRNA建库测序和生信分析服务。

研究结果

1. IL-6使cGGNBP2上调，与ICC病人预后相关

ICC患者血清中IL-6水平与较大的肿瘤大小、多发肿瘤数量、淋巴结浸润和不良预后显著相关。对IL-6处理的RBE细胞进行circRNA测序，共鉴定出3951个差异circRNA（3055个已知），9个显著上调，7个显著下调。qPCR、RNaseR对测序结果进行了验证，发现circRNA GGNBP2（cGGNBP2）在IL-6处理的细胞中显著上调。在136对ICC肿瘤组织和癌旁组织中评估cGGNBP2的临床相关性，发现cGGNBP2高表达与血清糖类抗原19-9水平升高、肿瘤大小增大、肿瘤数量增多、淋巴结转移和晚期肿瘤分期显著相关，表明cGGNBP2被IL-6上调，可能作为ICC患者的预后因素。

图1  circRNA测序结果

2. DHX9调控cGGNBP2的表达

对IL-6处理的细胞进行RNA-seq发现与circRNA形成相关的RBPs DHX9可被IL-6下调；40例ICC患者肿瘤组织中DHX9的表达与血清IL-6水平呈负相关；136例ICC组织中cGGNBP2的表达与DHX9的组织化学评分呈负相关；DHX9沉默使cGGNBP2表达水平显著上调。circRNA的成环机制受到内含子2和6的RCM（反向互补配对）的调控。RIP实验验证DHX9与核内ggnbp2基因pre-mRNA转录本内cGGNBP2的RCM结合从而增强转录后水平cGGNBP2的表达。

图2 cGGNBP2成环机制

3.阐明cGGNBP2生物学功能：cGGNBP2在体内外促进ICC细胞生长和转移

体外敲除和过表达实验表明cGGNBP2具有促进细胞增殖和细胞侵袭能力；在体内，cGGNBP2的沉默可显著抑制肿瘤生长，过表达可加速肿瘤生长。小鼠肝移植和肺转移模型中，cGGNBP2基因敲除导致较少的转移灶，相反，增强的cGGNBP2促进转移。因此，cGGNBP2在体内外具有促进ICC细胞生长和转移的功能。

4.新机制挖掘：cGGNBP2编码184个氨基酸的新型蛋白

通过circRNADb数据库鉴定出cGGNBP2的一个具有编码184aa蛋白潜能的高度保守的ORF和IRES序列。质谱分析证实cGGNBP2编码184个氨基酸的蛋白质（cGGNBP2-184aa）。根据其氨基酸序列（KKNKRCQLHSLDTHKPK）制备的抗体能够特异性识别GGNBP2和cGGNBP2-184aa。与cGGNBP2一致，cGGNBP2-184aa可通过IL-6刺激以浓度和时间依赖性方式上调。

图3 cGGNBP2的ORF与IRES

5.挖掘蛋白功能：cGGNBP2-184aa在体外促进ICC细胞生长和转移

构建cGGNBP2-184aa-ORF表达载体，以及IRES-MUT载体。免疫荧光实验证实cGGNBP2-184aa主要位于细胞质内。IRES-MUT细胞系中cGGNBP2表达量显著升高，cGGNBP2-184aa基本不变；过表达cGGNBP2-184aa-ORF的细胞系中cGGNBP2-184aa的表达显著增强，而cGGNBP2不变。因此，是cGGNBP2-184aa表达上调而不是IRES-MUT cGGNBP2表达上调促进了ICC细胞增殖和转移。

图4 cGGNBP2-184aa促进ICC细胞生长与转移  

6.深入探讨蛋白促进细胞生长的机制研究：cGGNBP2-184aa促进ICC细胞中STAT3磷酸化

IRES-MUT和OE-cGGNBP2过表达稳定细胞系的RNA-seq结果发现292个差异上调基因和240个差异下调基因。功能富集分析表明cGGNBP2-184aa过表达显著激活了JAK-STAT信号通路。STAT3是JAK-STAT途径的关键转录因子, cGGNBP2-184aa过表达显著促进了STAT3在Tyr705位点的磷酸化。亚细胞蛋白组分分析表明cGGNBP2-184aa过表达显著加速磷酸化的STAT3Tyr705的核易位。双荧光素酶报告实验显示，cGGNBP2-184aa表过达显著增强STAT3反应元件的活性。功能得失实验确定cGGNBP2-184aa增强的STAT3Tyr705磷酸化影响细胞增殖、迁移和侵袭，表明IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3形成了一个正反馈回路。

图5 cGGNBP2-184aa激活AK-STAT信号通路

7. 阐明cGGNBP2-184aa上调STAT3Tyr705磷酸化的机制：cGGNBP2-184aa与STAT3相互作用以促进其转录活性

质谱与IP实验发现cGGNBP2-184aa和STAT3之间存在相互作用；共免疫沉淀实验证明STAT3的DNA结合域（DBD）能够结合cGGNBP2-184aa（62-122），cGGNBP2-184aa（62-122）增强了STAT3响应元件的荧光素酶活性和STAT3下游基因的mRNA表达；且cGGNBP2-184aa诱导的细胞增殖和侵袭也归因于cGGNBP2-184aa的相互作用区。总之，cGGNBP2-184aa与STAT3的DBD相互作用，激活JAK-STAT信号，在体外促进细胞增殖和转移。

图6 IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3正反馈回路

8.cGGNBP2-184aa在体内的作用及临床意义

在体内，动物模型试验表明cGGNBP2-184aa的过表达，而不是cGGNBP2，可加速肿瘤生长，促进STAT3的磷酸化以及ICC细胞的肺转移的肝转移。136例ICC患者的STAT3Tyr705磷酸化水平检测结果显示cGGNBP2和STAT3Tyr705磷酸化之间显著正相关；皮下注射IL-6后，与体外结果一致，IL-6刺激增加cGGNBP2-184aa表达和STAT3Tyr705磷酸化，同时抑制体内凋亡程序。注射IL-6中和抗体可逆转IL-6的作用。

结论

CircRNA GGNBP2（cGGNBP2）通过IL-6处理以时间和浓度依赖性方式上调。cGGNBP2的生物发生受RNA结合蛋白DHX9调控；cGGNBP2编码的新蛋白-cGGNBP2-184aa在体内外促进ICC细胞增殖和转移。在机制上，cGGNBP2-184aa直接与STAT3相互作用，使STAT3磷酸化，并在调节IL-6/STAT3信号中发挥积极的调节作用。IL-6/cGGNBP2-184aa/STAT3形成一个正反馈回路，以维持IL-6/STAT3信号的结构性激活。cGGNBP2表达升高与ICC患者预后不良相关，并被确定为患者预后的独立危险因素，可作为ICC临床IL-6/STAT3靶向治疗的辅助靶点。 

研究思路

参考文献

[1] Li H., Lan T., Liu H.L., et al. IL-6 induced cGGNBP2 encodes a novel protein to promote cell growth and metastasis in intrahepatic cholangiocarcinoma. Hepatology. 2021. doi: 10.1002/hep.32232.