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首篇：国内基于Astral质谱的蛋白质组客户文章终于获发表。这篇文章不仅是我们基于Astral质谱的首篇研究成果，更是作者在该领域取得的重要突破。推创新、重积累，并始终以客户为中心是诺禾人的重要理念。客户研究成果的发表是对于我们工作的肯定，也是我们取得的不断突破的见证。

以下是对这篇文章的解析。

 

Mn(II)氧化细菌（MnOB）在环境中广泛存在，负责将Mn(II)氧化为BioMnOx。与化学合成的MnOx相比，BioMnOx具有更强的氧化性能，可吸附或氧化有机物和重金属。研究表明，Mn循环和碳循环在环境中存在耦合，主要集中在BioMnOx的氧化还原转化上。然而，大多数MnOB利用天然或简单碳源，关于MnOB在碳循环中的独立作用及其多种碳源利用能力的研究较少。目前的研究主要集中在群落水平上碳源依赖性MnOB对Mn氧化能力的影响，纯培养水平上的证据仍然缺乏，外源性代谢与BioMnOx的相互作用也成为研究热点。

 

 

今年5月05日，大连理工大学盘锦校区海洋科学与技术学院工业生态与环境工程教育部重点实验室周豪团队在《Journal of Hazardous Materials》(IF=13.6)上在线发表了题为“Can xenobiotics support the growth of Mn(II)-oxidizing bacteria (MnOB)? A case of phenol-utilizing bacteria Pseudomonas sp. AN-1”的最新研究成果。研究分离出一种Mn(II)氧化细菌Pseudomonas sp. AN-1菌株，该菌株能够利用苯酚作为唯一碳源，探讨了异源物质（xenobiotics）对Mn(II)氧化细菌（MnOB）生长的支持。生物锰氧化物（BioMnOx）因其卓越的吸附和氧化能力广受关注，但此前研究主要集中于BioMnOx的作用，而对MnOB自身的研究较少。借助基因组和蛋白质组学分析方法，本研究揭示了Pseudomonas sp. AN-1的Mn(II)氧化和苯酚矿化机制。诺禾致源为该研究提供 Rapid DIA蛋白质组学技术检测。 

 

研究思路

 

 

研究结果

 

01探索苯酚降解与锰氧化双重能力的新菌株

 

研究人员成功分离出了一株能够利用苯酚作为唯一碳源的细菌，并将其命名为AN-1。这株细菌显示出优异的苯酚降解能力。在含有Mn(II)的培养基上，AN-1菌落经过3天培养呈现出独特的棕色，并在加入LBB后转变为深蓝色。扫描电子显微镜（SEM）显示，AN-1为杆状细菌，长度约为0.8-1.5微米，宽度约为0.4-0.6微米。基因鉴定结果显示，AN-1与Pseudomonas oryzae KCTC 32247的16S rRNA序列相似度高达99.31%。全基因组序列分析进一步支持了它们的密切关系。计算AN-1和KCTC 32247之间的平均核苷酸相似性（ANI）和DNA-DNA杂交（dDDH）值分别为89.85%和38.7%，根据标准，这表明AN-1是Pseudomonas属中的一个新物种。Pseudomonas属细菌以其利用各种芳香化合物作为唯一碳源的多样性而著称。例如，Pseudomonas sp. EGD-AKN能够降解苯酚、甲苯、苯甲酸酯和儿茶酚，甚至包括三嗪类除草剂。此外，P. putida MnB1和P. fluorescens GB-1等菌株已知具有Mn(II)氧化能力。然而，Pseudomonas sp. AN-1是首个被报道同时具备苯酚利用和Mn(II)氧化能力的菌株。

 

图1 利用锰氧化苯酚的细菌的分离与鉴定

 

02AN-1菌株产生的生物锰氧化物（BioMnOx）表征

 

通过对Pseudomonas sp. AN-1培养产物的SEM图像和元素映射分析，发现BioMnOx复杂地包裹在细菌细胞周围。X射线衍射（XRD）图谱显示BioMnOx具有无定形特性，这与先前的研究一致。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析表明，在存在和不存在Mn(II)的情况下，细菌细胞中的主要官能团包括在3285 cm−1处的-OH伸缩振动和1081 cm−1处的C-O伸缩振动，以及在1653 cm−1处的C=O伸缩振动和1537 cm−1处的N-H和C-N伸缩振动。这些显著的官能团表明细菌沉淀和胞外聚合物物质参与了生物沉淀过程。

 

特别是在与Mn(II)共同培养的生物沉淀中，在493 cm−1处检测到了Mn-O键，表明存在锰氧化物。X射线光电子能谱（XPS）分析显示，Mn 3 s光谱的峰分离为5.2 eV，对应的平均氧化态（AOS）为3.10。通过上述综合表征，确立了在AN-1菌株的存在下确实发生了Mn(II)氧化。

 

图2 菌株AN-1生成BioMnOx的表征

 

03苯酚浓度和pH对AN-1菌株生长和苯酚降解的影响

 

在含有100 mg/L苯酚和Mn(II)的培养基中，OD600值达到了最大值约0.12。不同浓度的苯酚显著影响了AN-1菌株的生长速度和生物量。随着苯酚浓度的增加，滞后期延长，尤其是在500 mg/L苯酚浓度下达到28小时。菌株在50 mg/L苯酚浓度下生长最快，但最终细菌浓度（约0.08）显著低于200 mg/L苯酚浓度下的浓度（约0.21）。初始苯酚浓度的提高与苯酚去除率的降低相关，完全去除苯酚仅在200 mg/L以下的浓度下实现，而在500 mg/L的浓度下苯酚降解效率仅为32%。

 

不同苯酚浓度下的矿化程度也进行了评估。当初始苯酚浓度为50 mg/L和100 mg/L时，几乎100%的总有机碳（TOC）被去除。然而，在200 mg/L苯酚浓度下，仅去除了87%的TOC，这表明AN-1菌株在较低苯酚浓度下具有完全矿化苯酚的能力。

 

培养基的pH值也影响了苯酚的去除效率。在pH 5.5和8.0时细胞生长未发生，但在pH 6.5时，苯酚在18小时内被完全去除。在pH 6.0和7.5时，苯酚降解略有延迟，但最终去除率达到了100%。这种在中性和微酸性环境中较高的C23O活性可能是由于较高的pH值会导致细胞膜通透性下降。

 

此外，探讨了Mn(II)添加对苯酚降解的影响，发现较低的Mn(II)浓度会减缓AN-1菌株的苯酚降解，而较高的Mn(II)浓度几乎没有影响。之前的研究表明，Mn(II)的存在可以增加C12O和C23O的活性，从而加速苯酚降解。此外，Mn(II)作为额外的电子供体被Zoogloea sp. MFQ7利用，加速了锰氧化物的形成，从而促进了苯酚的去除。考虑到苯酚废水通常含有重金属离子，AN-1菌株在废水处理方面也具有实际应用价值，利用更廉价的碳源和合适的固定化方法富集这些细菌细胞可能有助于扩大其应用规模。

 

图3 AN-1的苯酚降解特征

 

04苯酚降解酶活性分析

 

苯酚的生物降解初始步骤是通过苯酚羟化酶将苯酚转化为儿茶酚。随后，儿茶酚通过两种途径进一步降解：邻位开环途径（C12O）和间位开环途径（C23O）。在存在和不存在Mn(II)的情况下，测定了C12O和C23O的活性。在100 µM Mn(II)下，C12O和C23O的比活性分别为0.40 U/mg和1.43 U/mg，而在没有Mn(II)的情况下分别为0.38 U/mg和1.47 U/mg。这些酶活性与之前报道的苯酚降解Pseudomonas菌株的活性相似。这些结果表明，AN-1菌株可以通过邻位和间位开环途径来代谢苯酚。

 

05Pseudomonas sp. AN-1的Mn(II)氧化特性

 

研究初步探讨了苯酚浓度对AN-1菌株Mn(II)氧化的影响。苯酚浓度为50 mg/L和100 mg/L时，Mn(II)氧化达到了最大水平（100%）。然而，在200 mg/L时效率降至60%，在500 mg/L时几乎没有观察到Mn(II)氧化。高苯酚浓度显著阻碍了Mn(II)氧化，这在其他研究中未见报道。值得注意的是，这种效应并不是由于生长抑制引起的，因为在500 mg/L苯酚浓度下的细菌生物量超过了在50 mg/L苯酚浓度下的生物量，类似现象也出现在镍（Ni(II)）添加对Pseudomonas putida GB-1 Mn(II)氧化的影响中。

 

研究还探讨了碳源浓度对Mn(II)氧化的影响。在存在和不存在Mn(II)的情况下，测定了苯酚浓度对C12O和C23O活性的影响。苯酚浓度为50 mg/L和100 mg/L时，C12O和C23O的比活性分别为0.40 U/mg和1.43 U/mg，而在200 mg/L苯酚浓度下，C12O和C23O的比活性分别为0.30 U/mg和1.30 U/mg。高苯酚浓度显著阻碍了Mn(II)氧化。

 

此外，研究人员还注意到Cu(II)和Ni(II)对AN-1菌株Mn(II)氧化的影响，在10 µM/100 µM Cu(II)或100 µM Ni(II)浓度下，菌株的生长和Mn(II)氧化完全抑制。然而，在10 µM Ni(II)浓度下，尽管菌株生长正常，Mn(II)氧化仍然受到抑制。

 

图4 Ban-1以苯酚浓度依赖的方式氧化锰

 

06基因组分析 Pseudomonas sp. AN-1

 

为了进一步解释AN-1菌株的苯酚生物降解和Mn(II)氧化过程，对其基因组进行了测序。AN-1菌株的完整基因组包含一个染色体（4.61 Mbp），GC含量为68.14 mol%，预测基因数量为4213个。注释结果表明，AN-1菌株可以利用多种碳源，如乙酸、丙酸、柠檬酸、琥珀酸、苯甲酸、苯乙酸和葡萄糖，并具有完整的硝酸盐同化和氮固定基因。

 

AN-1菌株具有138个芳香化合物降解基因，通过KEGG注释，仅发现了编码C23O的同源基因，表明AN-1菌株通过meta裂解途径降解苯酚。未发现C12O编码基因，但存在编码均苯四酸1,2-双加氧酶（H12D）的基因。基因组中缺少儿茶酚邻位裂解途径的3-氧代己二酸CoA转移酶（EC: 2.8.3.6）编码基因，进一步支持AN-1菌株通过meta裂解途径降解苯酚。

 

图5 AN-1降解苯酚的推测机制

 

在解释Mn(II)氧化功能时，发现了编码MnxG和McoA的基因，类似于Pseudomonas aeruginosa GB-1。还发现了一个编码KatG的基因，与StKatG具有58%的序列同一性。虽然KEGG没有注释编码AHP的基因，但RAST服务器的Blast结果显示存在两个AHP编码基因，这些基因与已知细菌中使用AHP直接进行Mn(II)氧化的基因具有高度同源性。

 

07蛋白质组学分析Pseudomonas sp. AN-1

 

为了阐明AN-1菌株在利用不同碳源条件下Mn(II)氧化的分子机制，进行了蛋白质组学分析。总共鉴定到3140种蛋白质，其中与Mn(II)氧化相关的蛋白质有9种。结果显示，在添加苯酚条件下，Mn(II)氧化蛋白质的表达水平显著高于以葡萄糖作为碳源的对照组。这表明，AN-1菌株在苯酚存在条件下会调控其蛋白质表达，从而增强其Mn(II)氧化能力。

 

此外，蛋白质组学分析还发现了参与苯酚降解途径的多种酶类，包括苯酚羟化酶、儿茶酚1,2-双加氧酶和儿茶酚2,3-双加氧酶。这些酶的表达水平在苯酚存在条件下显著上调，进一步支持了AN-1菌株能够有效降解苯酚的结论。

图6 不同苯酚浓度下AN-1的相对基因表达分析

 

研究结论

 

Pseudomonas sp. AN-1菌株具有同时降解苯酚和氧化Mn(II)的能力。蛋白质组学分析揭示了该菌株在不同碳源条件下的分子机制，显示出其在环境污染物处理方面的潜力。未来的研究可以进一步探讨AN-1菌株在实际应用中的表现，以及其与其他微生物的协同作用。

 

假单胞菌体内苯酚降解及锰氧化模型

 

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参考文献：

Qiao A, Pan H, Zang J, Zhang Y, Yi X, Liu Y, Zhan J, Yang X, Zhao X, Li A, Zhou H. Can xenobiotics support the growth of Mn(II)-oxidizing bacteria (MnOB)? A case of phenol-utilizing bacteria Pseudomonas sp. AN-1. J Hazard Mater. 2024;469:134095.